ADAMTS-1: dezintegracja metaloproteinazy niezbędna do prawidłowego wzrostu, płodności oraz morfologii i funkcji narządu ad

Aby odkryć fizjologiczne i patofizjologiczne role ADAMTS-1 i uzyskać wgląd w biologię rodziny białek ADAMTS, wybraliśmy strategię kierowania genów u myszy. Tutaj pokazujemy wiele ról dla ADAMTS-1 w prawidłowym wzroście, płodności oraz strukturze i funkcji narządów. Metody Wytwarzanie myszy ADAMTS-1 (null. Fragment o długości 12,0 kb obejmujący egzon a7 mysiego genu ADAMTS-1 subklonowano do pBluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Wektor celujący skonstruowano przez zastąpienie fragmentu EcoRI-Bglll 1,6 kb zawierającego eksony 2 (4 z genem oporności na neomycynę i flankiem genu kinazy tymidynowej. Ten plazmid linearyzowano NotI i wprowadzono do komórek embrionalnego trzonu (ES) pochodzących od 129 / Sv3 przez elektroporację. Komórki ES wybrano w pożywce zawierającej G418 i gancyklowir. Homologiczne rekombinanty zidentyfikowano za pomocą PCR i analizy Southern blot. Dwa niezależnie ukierunkowane klony komórek ES wstrzyknięto do blastocyst C57BL / 6 w celu wytworzenia chimerycznych myszy. Męskie chimery krzyżowano następnie z samicami C57BL / 6, a transmisję linii zarodkowej uzyskano z dwóch niezależnych klonów ES. Noworodki otrzymane przez hodowlę heterozygot z genem tła hybrydy 129 / Sv × C57BL / 6 zastosowano do analizy fenotypowej. RT-PCR. Całkowity RNA przygotowano z nerek przy użyciu RNAzolu (BIOTEX), a RT-PCR przeprowadzono na uzyskanych próbkach cDNA. Zestawy primerów zostały wybrane, jak pokazano na rysunku 1a, na górze; a sekwencje są następujące: Figura Niwelowane zakłócanie mysiego genu ADAMTS-1. (a) Genomowe locus, targetinging vector i przewidywane docelowe locus. Czarne skrzynki reprezentują eksony 1. 9. Wskazano sondę do analizy Southern. B, BamHI; E, EcoRI; G, BglII. (b i c) Południowa analiza genomowego DNA z docelowych komórek ES (b) i potomka heterozygoty między krzyżami (c). Fragment EcoRI 7,0 kb i fragment BamHI 11,5 kb oznaczają homologiczny zrekombinowany allel. (d) RT-PCR całkowitego RNA wyekstrahowanego z nerki każdego genotypu. W ADAMTS-1 nie wykryto ekspresji ADAMTS-1. /. myszy. (a) Sense primer 5. -CGCTTCCATAACAATGCTGC-3. i starter antysensowny 5a-CCTCAGGATGTGGAACTGCG-3. zostały wybrane w eksonie 1. (b) Sense starter 5. -CGCAGTTCCACATCCTGAGG-3. wybrano w eksonie 1, a starter antysensowny 5a-GCTGGACACAAATCGCTTCT-3. wybrano w egzonie 2. (c) Sense starter 5. -CAGGAAGCATAAGGAAGAAG-3. wybrano w ramach egzonu 2 i starter antysensowny 5a-GGCTTGTCCATCAAACATTC-3. wybrano w ramach egzonu 5. (d) Sense primer 5. -CAGGAAGCATAAGGAAGAAG-3. wybrano w eksonie 2, a starter antysensowny 5a-GCACAGTGCTTAGCATCATC-3. wybrano w ramach egzonu 4. (e) Sense Sense primer 5. -TTTTCAGAGTCTGGCAGAAG-3. i starter antysensowny 5a-TGAGATGAGTGATCACCATG-3. wybrano w eksonie 9. Trzydzieści cykli (95 ° C przez minutę, 62 ° C przez minutę, 72 ° C przez minutę) użyto do amplifikacji produktów, które następnie poddano elektroforezie. Badanie histologiczne. Próbki nerek, nadnerczy, macicy i jajników utrwalono w 10% formalinie buforowanej fosforanem (pH 7,4), zatopiono w parafinie i pocięto na sekcje o wymiarach 4 .m. Skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną lub Mallory-azanem i badano pod mikroskopem świetlnym. Macicę i jajniki pobrano po 24 godzinach traktowania (podskórnie) 0,1 ug 17- (3-estradiolu. Immunohistochemia. Zatopione w parafinie skrawki tkanki nerkowej odwarstwiono za pomocą Histo-Clear (National Diagnostics, Tokio, Japonia) i ponownie uwodniono przy stopniowanym stężeniu etanolu. Po zablokowaniu awidyną, biotyną i 1% odtłuszczonym mlekiem, skrawki tkanek inkubowano z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw domenie metaloproteinazy mysiego białka ADAMTS-1 lub normalnej króliczej IgG przez noc w 4 ° C. Skrawki przepłukano, a następnie inkubowano przez 30 minut z biotynylowaną świńską anty-króliczą Ig (rozcieńczenie 1: 400) (DAKO, Kopenhaga, Dania). Skrawki tkanki następnie przepłukano i inkubowano przez 30 minut streptawidyną znakowaną alkaliczną fosfatazą (rozcieńczenie 1:70). Szkiełka ponownie płukano w PBS i poddawano reakcji z roztworem substratu fosfatazy alkalicznej (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) zawierającym mM lewamizolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec skrawki przepłukano i wybarwiono kontrastowo zielem metylowym. Mikroskopia elektronowa. Małe części próbek utrwalono za pomocą aldehydu glutarowego i tetratlenku osmu, a następnie osadzono w Epon 812 (Oken Shoji Co., Tokio, Japonia). Z tych osadzonych tkanek wycięto skrawki 0,1-.m, dwukrotnie wybarwiono octanem uranu lub kwasem fosfowolframowym i cytrynianem ołowiu i zbadano za pomocą mikroskopu elektronowego Hitachi H-600 (Hitachi Co., Tokio, Japonia). Dożylna pirografia
[hasła pokrewne: frytki z piekarnika kalorie, pogotowie stomatologiczne gdańsk, leczenie uzależnienia od hazardu ]
[patrz też: nadciśnienie tętnicze profilaktyka, pogotowie stomatologiczne gdańsk, dieta dukana faza uderzeniowa ]