ADAMTS-1: dezintegracja metaloproteinazy niezbędna do prawidłowego wzrostu, płodności oraz morfologii i funkcji narządu cd

Po wywołaniu znieczulenia za pomocą dootrzewnowego pentobarbitalu do żyły ogonowej każdej myszy wstrzyknięto 0,1 ml czynnika nieprzepuszczającego promieniowania (amidotrizo-nian megluminy sodu) rozcieńczonego do 1: sterylną solą fizjologiczną. Filmy rentgenowskie pobierano w 5, 10, 15 i 30 minut po wstrzyknięciu. Analiza statystyczna. Wartości ilościowe wyrażono jako średnie. SEM. Do określenia istotnych różnic wykorzystano test ucznia. Wartość P <0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki Generowanie myszy ADAMTS-1 null. Docelowy konstrukt DNA zaprojektowano w celu zastąpienia egzonów 2 (4, kodujących większość domeny metaloproteinazy (12, 13), genem oporności na neomycynę (Figura 1a). Wektor celujący wprowadzono do komórek ES pochodzących z 129 / Sv przez elektroporację, a docelowe klony ES (Figura 1b) wstrzyknięto następnie do blastocyst C57BL / 6. Jak potwierdzono metodą Southern blotting, sześć chimer uzyskanych z dwóch niezależnych klonów ES wykazało transmisję z zarodka docelowego allelu (Figura 1c). Wśród potomstwa klonów, ADAMTS-1 + /. heterozygoty miały normalny wygląd i były płodne. Przez krzyżowanie heterozygot uzyskaliśmy żywą ADAMTS-1. /. homozygot. Używając wszystkich możliwych zestawów primerów RT-PCR, jak pokazano na rysunku 1a (u góry), nie mogliśmy wykryć wzmocnionych pasm z ADAMTS-1. /. szablony; w związku z tym nawet skrócone mRNA ADAMTS-1 nie zostało skutecznie transkrybowane w ADAMTS-1. /. myszy. Figura 1d pokazuje wynik RT-PCR za pomocą zestawu starterów (d). Opóźnienie wzrostu u myszy ADAMTS-1 null. ADAMTS-1. /. myszy były mniejsze niż ich rodzeństwo z miotu dzikiego, chociaż ich proporcje były prawidłowe (Figura 2a). Zmniejszenie masy ciała ADAMTS-1. /. myszy były już znaczące przy narodzinach i później zostały zaakcentowane (Figura 2b): po 9 miesiącach średnia masa ciała ADAMTS-1. /. myszy stanowiły jedynie około 70% myszy z ich rodzeństwa typu dzikiego lub heterozygotycznego (fig. 2c). ADAMTS-1. /. myszy były wyjątkowo szczupłe, a objętość tłuszczu najądrza była znacznie mniejsza w ADAMTS-1. /. myszy (Figura 2, d i e). Badanie histologiczne nie wykryło widocznych zmian w ADAMTS-1. /. tkanki tłuszczowe z wyjątkiem względnie niewielkich rozmiarów poszczególnych adipocytów (dane nie przedstawione). Poziomy wskaźników żywieniowych w surowicy nie różniły się istotnie pomiędzy ADAMTS-1. /. i samce ADAMTS-1 + / + (odpowiednie wartości: cholesterol całkowity, 92,0. 6,7 mg / dl vs. 100,3. 12,0 mg / dl, n = 7 w każdym, glukoza, 174,7 . 22,7 mg / dl vs. 168,1. 16,1 mg / dL, n = 7 w każdym, białko całkowite, 4,5. 0,2 g / dl, n = 10 w stosunku do 4,6. 0,4 g / dL, n = 9). Rysunek 2 Opóźnienie wzrostu w ADAMTS-1. /. myszy. (a) Wystąpienie 1-tygodniowego ADAMTS-1 + / + (po lewej) i ADAMTS-1. /. (po prawej) rodzi się z miotu. (b) Porównanie wzrostu po urodzeniu między ADAMTS-1 + / + (n = 10) a ADAMTS-1. /. (n = 9) z miotu. AP <0,05 w porównaniu do rodzeństwa z miotu typu dzikiego. (c) Porównanie masy ciała wśród 9-miesięcznych ADAMTS-1 + / +, ADAMTS-1 + /. i ADAMTS-1. /. mioty z młodymi (n = 13 w każdym genotypie). BP <0,0001. (d i e) najądrzaste tampony i jądra z 12-tygodniowych ADAMTS-1 + / + (d) i ADAMTS-1. /. (e) dzieci z miotu. B, pęcherz; E, najądrza; F, poduszka tłuszczowa; T, jądra. Nieprawidłowości urologiczne u myszy ADAMTS-1-null. Najważniejsza cecha morfologiczna ADAMTS-1. /. myszy wykryto w nerce. W 4-tygodniowym ADAMTS-1. /. myszy, przestrzeń kaletki była znacznie powiększona, a tkanka korowo-śpiączkowa została poważnie zredukowana, tworząc cienkie obrzeże otaczające powiększony kielich (Figura 3, a (d)). U myszy zarówno na tle C57BL / 6J, jak i 129 / Sv, defekt ten obserwowano obustronnie z całkowitą penetracją. Brodawki myszy typu dzikiego wystają poza obszar i wypełniają większość przestrzeni miednicy, podczas gdy brodawki ADAMTS-1. /. myszy były słabo rozwinięte lub praktycznie nieobecne (Figura 3, a (d)). Mikroskopia elektronowa wykazała degenerację komórek nabłonka przewodu zbiorczego i śródmiąższowe zwłóknienie (danych nie pokazano). Nieznaczne, ale znaczące powiększenie przestrzeni kaletki za pomocą brodawek hipoplastycznych lub zanikowych zaobserwowano po raz pierwszy w wieku około tygodnia, co sugeruje, że fenotyp nerek pojawia się po urodzeniu i rozwija się stopniowo. Co do czynności nerek, nie mogliśmy wykryć żadnych oznak ciężkiej niewydolności nerek w ADAMTS-1. /. myszy. Stężenie kreatyniny w surowicy (Cr), azotu mocznikowego we krwi (BUN) i klirensu kreatyniny (CCr) nie różniły się istotnie pomiędzy ADAMTS-1. /. i samce ADAMTS-1 + / + (odpowiednie wartości: Cr, 0,078. 0,006 mg / dL, n = 11 vs. 0,103. 0,022 mg / dl, n = 17, BUN, 25,6 . 1,6 mg / dL, n = 16 vs. 26,4 . 1,8 mg / dL, n = 12; Ccr 0,64-0,09 ml / min, n = 6 wobec 0,70 . 0,09 ml / min, n = 8). Natomiast zdolność koncentracji moczu została znacznie zmniejszona w ADAMTS-1. /. myszy na diecie 0,7% NaCl w porównaniu z myszami ADAMTS-1 + / + i zwiększono objętość moczu (2,37 . 0,27 ml u myszy / u myszy, n = 4 vs. [przypisy: frytki z piekarnika kalorie, ziemniaki pieczone przepis, kolposkopia szyjki macicy ] [podobne: implanty dąbrowa górnicza, palenie papierosów a karmienie piersią, kolposkopia szyjki macicy ]