Apo AI hamuje tworzenie komórek piankowatych u myszy z niedoborem apoE3 po przyleganiu monocytów do śródbłonka ad

W 2 eksperymentach z liofilizacją myszy C57BL / 6 apo E (15) i myszy transgeniczne Apo A C57BL / 6 człowieka (12), uzyskane z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA), zostały skrzyżowane uzyskuje się myszy transgeniczne z ludzkim apo AI pozbawione C57BL / 6 apoE3. Do tego doświadczenia użyto miotów pierwszej generacji otrzymanych z krzyżówek C57 E0 x C57 E0 / hA-I. W tym tekście, myszy z tłem C57BL / 6 oznaczono jako C57, aby odróżnić je od myszy o mieszanym podłożu genetycznym. Obecność ludzkiego transgenu apo AI wykryto w osoczu stosując ludzki test ELISA Apo, jak opisano poniżej. Do tego badania wybrano myszy E0 / hAI z ludzkimi poziomami apo AI wyższymi niż 200 mg / dL i odpowiadającymi im myszami z miotu E0. HDL-C zmierzono na podgrupie myszy, jak opisano wcześniej (16). HDL-C był 2-krotnie wyższy u myszy E0 / hAI w porównaniu z myszami E0 (średnia wartość SE: 71 <3, n = 19 vs. 34. 2, n = 16, P <0,0001). Ludzki apo AI ELISA: pomiar apo AI. Mysz przeciw ludzkiemu apo AI mAb (BIODESIGN International, Kennebunk, Maine, USA), rozcieńczony 1: 300 w buforze wodorowęglanowym, zastosowano do studzienek płytek Nunc Maxisorb ELISA (Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA) i inkubowano przez noc w 4 ° C. Wszystkie kolejne inkubacje prowadzono w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Studzienki przemyto PBS i zablokowano blokerem kazeinowym (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) na godzinę. Rozcieńczone wzorce (Diasorin Inc., Stillwater, Minnesota, USA) i próbki osocza, rozcieńczone 1: 800 000 w kazeinie / 0,5% Tween-20, nałożono do studzienek na godzinę. Płytki przemyto PBS / Tween-20 (0,5%) i przez godzinę nanoszono rozcieńczenie 1: 1000 koziego przeciwciała przeciwko ludzkiemu apo AI (BIODESIGN International). Po płukaniu, mysią anty-kozią IgG (Pierce Chemical Co.) naniesiono przez godzinę. Enzym peroksydazy chrzanowej wykrywano przez inkubację z substratem TurboTMB (Pierce Chemical Co.). Reakcję zakończono M kwasem siarkowym i zmierzono absorbancję przy 450 nm na czytniku płytek SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA). Zanikanie i głębokie trawienie mikroskopu elektronowego. Serce z dołączoną aortą szybko usunięto ze zwierząt i umieszczono w natlenionym roztworze Ringera buforowanym fosforanem, jak opisano wcześniej (13). Kawałki tkanek (2 x mm) usunięto z łuku aorty z wybranych miejsc, jak opisano wcześniej (13), położyliśmy stronę śródbłonka na wilgotnej bibule filtracyjnej nad prostokąciami żelatyny, i ultraprawnie zamrożono na wysoko wypolerowanym ciekłym chłodzonym azotem. blok. Zamrożone kawałki aorty zostały złamane w temperaturze około 150 ° C pod próżnią x 10 ~ 7 w aparacie do liofilizacji Balzers 301 (Balzers Instruments, Balzers, Lichtenstein). Głęboko wytrawione repliki z obrotowym cieniem zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem (17, 18). Wykonano zdjęcia każdej repliki. Jedynym procesem selekcji było sfotografowanie fragmentów repliki, w których płaszczyzna pęknięcia przechodzi przez błonę wewnętrzną. Każde zdjęcie zostało zrobione na poziomie 10 000. Umożliwiło to obserwatorowi określenie poziomu płaszczyzny pęknięcia, ale nie szczegółów matrycy, zapewniając w ten sposób, że błąd nie wszedł w zbieranie danych. Każdy negatyw został powiększony fotograficznie, aby cząsteczki lipidów były widoczne w matrycy w celu oceny. Na zdjęciach nałożono przezroczystą siatkę zawierającą 16 prostokątów (powierzchnia każdego prostokąta = 5,34 m2), a prostokąty oceniano pod kątem obecności lub braku lipidów. Aby określić, czy na ilość złogów lipidów w każdym obszarze wpłynęły podwyższone apo AI i HDL-C, otrzymano 29 replik z myszy C57BL / 6 E0 / hA-I (n = 2), a 30 replik uzyskano z C57BL / 6 myszy E0 (n = 2). W tych eksperymentach oceniano tylko obszary wewnątrz błony wewnętrznej zawierające lipid. W celu ilościowego oznaczenia ilości lipidów obecnych w błonie wewnętrznej w obu genotypach, każdą przestrzeń siatki oceniano w następujący sposób: typ 1, większy niż połowa powierzchni wypełniona zagregowanym lipidem; typ 2, więcej niż 2 skupiska zagregowanego lipidu w obszarze; i typ 3, poszczególne cząstki lipidów zdyspergowane w tym obszarze. Transmisyjna mikroskopia elektronowa. Cienkowarstwową mikroskopię elektronową przeprowadzono na tkance pobranej z okresowego pobierania próbek przez łuk aorty. Aortę wycięto i uwolniono od otaczającej tkanki łącznej, utrwalono w aldehydie glutarowym, a następnie tetratlenku osmu, odwodniono w gradiencie alkoholu i osadzono w Eponie, jak opisano poprzednio (13). Przekroje poprzeczne wycinano w celu łatwej identyfikacji monocytów przylegających do ściany komórkowej śródbłonka. Zbadano dwa zwierzęta z każdego genotypu (10 próbek tkanek × 5 przekrojów na 50 skrawków na aortę). Immunohistochemia [przypisy: chemioterapia adjuwantowa, cukrzycowa choroba nerek, zdrowe jedzenie przepisy ] [patrz też: chemioterapia adjuwantowa, laboratorium elbląg ul nowowiejska, chirurgia stomatologiczna gdańsk ]