Apo AI hamuje tworzenie komórek piankowatych u myszy z niedoborem apoE3 po przyleganiu monocytów do śródbłonka cd

Myszy znieczulono i pobrano krew z nakłucia lewej komory do strzykawek zawierających EDTA. Układ krążenia perfundowano 0,9% NaCl przez kardiatryczną dokomorową kanalizację. Serce i aortę wstępującą, w tym łuk aorty, usunięto. Korzeń aorty i łuk aorty zamrożono w ośrodku zatapiającym OCT z użyciem chłodzonego ciekłym azotem izopentanu. Bloki OCT przechowywano w temperaturze ~ 70 ° C aż do skrawków pod kątem immunocytochemii. Sześciomikromowe zamrożone odcinki łuku aorty pocięto i pozostawiono do przyklejenia do szkiełek Fisher Plus. Wykonano 8-mikrometrowe skrawki aorty z anatomicznie zdefiniowanego obszaru korzenia aorty, zaczynając od pojawienia się płatków zastawki aortalnej i kończąc, gdy płaty aorty nie były już widoczne. Skrawki utrwalono acetonem przez 5 minut i poddano inkubacji 0,3% nadtlenek wodoru w celu zablokowania endogennej aktywności peroksydazy, a następnie zablokowano w normalnej surowicy królika. Pierwotne przeciwciało naniesiono przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Zastosowano następujące przeciwciała: szczurzą przeciwmysie mAb VCAM-1 (1: 250, Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA), szczurze przeciwciało kontrolne przeciwko mysiej IgG1 (1: 250, Vector Laboratories, Burlingame California, USA) szczurzą przeciw myszy CD11a (1: 1000, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Skrawki przemywano PBS i przez 45 minut nanoszono biotynylowane przeciwciało drugorzędowe królicze przeciwciało przeciwciało pochłonięte przez mysz (1: 200; Vector Laboratories), a następnie płukanie i inkubację 30-minutową z kompleksem awidyna-biotyna do peroksydazy chrzanu (Vector-Elite, Vector Laboratories). W celu barwienia przeciwciał CD11a sygnał wzmocniono stosując zestaw do amplifikacji sygnału tyramidu zgodnie z instrukcjami producenta (NEN Life Science, Products Boston, Massachusetts, USA). Peroksydazę wykryto za pomocą 3-amino-9-etylokarbazolu (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA). Kontrole przeprowadzono z użyciem nieistotnego mAb dopasowanego pod względem izotypu lub bez przeciwciała pierwszorzędowego i nie zaobserwowano barwienia tła. Oznaczenie ilościowe komórek pozytywnych pod względem CD11a. Barwienie immunoperoksydazowe z zastosowaniem przeciwciała anty-CD11a zastosowano do wykrycia adherentnych jednojądrzastych komórek. Badania pilotażowe wykazały, że wizualne zliczanie komórek jednojądrzastych barwionych immunoperoksydazą nie było wiarygodne, ponieważ komórki jednojądrzaste przyjmują różne kształty, w zależności od tego, czy komórka jest przylegająca, czy w procesie rozprzestrzeniania się lub przechodzenia przez migrację przez śródbłonkową. W związku z tym obszar zajmowany przez zabarwione komórki oceniano ilościowo za pomocą komputerowego systemu przechwytywania wideo (Optimetrics, Bioscan, Inc., Edmonds, Washington, USA). Operator był zaślepiony w odniesieniu do genotypu zwierzęcia. Obszar zajmowany przez związane komórki jednojądrzaste mierzono na przekroju na szkiełko, w sumie 5 preparatów na zwierzę. Następnie 5 obszarów uśredniono. Pomiar esterazy arylowej i paraoksonaz. Krew pobrano z żyły ogonowej i zebrano w rurkach kapilarnych nie zawierających antykoagulantu. Mysią surowicę rozcieńczono w PBS i dodano do płytek do mikromiareczkowania. Dodano octan fenylu (esteraza arylowa, mM) lub paraokson (paraoksonaza; mM) w 20 mM buforze Tris (pH 8) i zmierzono zmianę w OD 270 nm (esteraza arylowa) lub OD405 nm (paraoksonaza) w test kinetyczny przez 2 minuty w czytniku płytek (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornia, USA) w temperaturze pokojowej. Względna aktywność aryloesterazy i paraoksonaz wyrażono jako nachylenie (. OD / s). Wszystkie próbki myszy do testów na esterazę arylową i paraoksonazę mierzono jednocześnie. Statystyka. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu Student. Wyniki Badanie ilościowe przeprowadzono przy użyciu metody mrożenia-pękania i głębokiego trawienia mikroskopu elektronowego, aby określić, czy podwyższony poziom apo AI zmniejszy zatrzymanie lipidu w śródjonu w myszach E0 / hA-I. Wcześniej wykazano, że lipid jest zatrzymywany w macierzy podśródbłonkowej już w wieku 3 tygodni u myszy z niedoborem Apo, podczas gdy podśródbłonkowa matryca myszy kontrolnych (typu dzikiego) nie zawiera złogów lipidów (13). Dwie grupy myszy uśmiercono w celu oceny złogów suble- pulialnych lipidów. Pierwsza grupa obejmowała 6-tygodniowe myszy C57 E0 (n = 2) i C57 E0 / hA-I (n = 2), a druga grupa zawierała 6-tygodniowe E0 (n = 2) i E0 / hA -I (n = 2) myszy o mieszanym pochodzeniu genetycznym. Błona środkowa w miejscach rozgałęzień w łuku aorty od myszy E0 i E0 / hA-I z obu genów miała lipidy związane z matrycą. Obecność lub brak złogów lipidów podśródbłonkowych, niezależnie od ilości lub konfiguracji lipidów w każdym obszarze, oceniono w sposób ślepy
[przypisy: chemioterapia adjuwantowa, aldemed zielona góra dermatolog, przepis na dietetyczne ciasto ]
[patrz też: cykl miesiączkowy kalkulator, wojewódzka przychodnia stomatologiczna, przychodnia langiewicza rzeszów ]