Endogenna regulacja terapeutycznego transgenu przywraca homeostazę w stawach artretycznych ad

Do napływu roztworu perfuzyjnego (0,5 ml PBS) użyto igły 30 G i do zbierania perfuzatu użyto igły o rozmiarze 22 G. Po odwirowaniu supernatanty zamrożono w celu późniejszej oceny ilościowej hIL-10. Osadzone komórki ponownie zawieszono, czerwone krwinki poddano lizie, a białe krwinki zliczono za pomocą licznika Coulter (Beckman Coulter Inc., Miami, Floryda, USA). Aby zmierzyć ekspresję lucyferazy in vivo, wycięte stawy skokowe sproszkowano w ciekłym azocie i ekstrahowano przez 30 minut na lodzie ml buforu do ekstrakcji (0,25 M Tris przy pH 7,5, 10 mM EDTA, mM EGTA, mM PMSF, 2,5 (ig / ml aprotyniny, 5 ug / ml leupeptyny i 2,5 ug / ml pepstatyny). Aktywność lucyferazy w ekstraktach określono za pomocą luminometru. Możliwy wpływ wygaszaczy lub wzmacniaczy aktywności lucyferazy w próbkach był kontrolowany przez określenie chemiluminescencji rekombinowanej lucyferazy w obecności ekstraktów stawowych. Przygotowanie i przechowywanie adenowirusów. Adenowirusy (Ad) wytworzono i oczyszczono jak opisano (11). Po miareczkowaniu każdy wirus zamrożono i przechowywano w temperaturze około 70 ° C. Bezpośrednio przed wstrzyknięciami IA wirusy rozmrożono i rozcieńczono solą fizjologiczną. W dwóch eksperymentach in vivo iw większości badań in vitro, wirusy Ad przechowywano w 67 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Tris (pH 7,4) i 50% glicerolu w. 20 ° C do 3 miesiące. O ile nie zaznaczono inaczej, Ad wstrzykiwano dostawowo w dniu 2, w 107 jednostek tworzących łysinki (PFU) na wstrzyknięcie. W porównaniu ze stawami wstrzykniętymi wstrzykniętymi wstrzyknięcie wektorów reporterowych (Ad.C3-tat / HIV-luc i Ad.RR5) powodowało wzrost średnicy stawu od dnia. 2 do dnia 0, ale nie miało wpływu na nasilenie nawrotów Wstrzyknięcie PG-APS w dniu 0. Hodowla komórkowa. Pierwotne szczurze fibroblasty maziowe uzyskano przez enzymatyczne rozproszenie eksplantatów błony maziowej szczurów z artretyzmem SCW (13). Komórki utrzymywano w RPMI 1640 z 15% FBS i stosowano w pasażach 5. 10. Metody immunodetekcyjne. Lizaty komórkowe rozdzielono na denaturującym 15% żelu SDS-poliakryloamidowym i przeniesiono na nitrocelulozę. hIL-10 wykrywano za pomocą poliklonalnego pierwotnego przeciwciała hIL-10 sc-1273 (1: 1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA). Kompleksy immunologiczne wizualizowano stosując drugorzędowe przeciwciało skoniugowane z peroksydazą chrzanową (1: 3 000) i zestaw Renaissance ECL (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). Aby ocenić hIL-10 in vivo, zebrano płyny maziowe (cztery stawy w każdym punkcie czasowym), czterdzieści mikrolitrów mieszaniny rozdzielono na żelu SDS-poliakryloamidowym i poddano immunodetekcji przeciwciałem hIL-10, jak powyżej. Ludzka rekombinowana IL-10 (Biosource International, Camarillo, Kalifornia, USA) zapewniała pozytywną kontrolę. Test ELISA hIL-10 przeprowadzono na kodowanych próbkach stosując przeciwciała i rekombinowaną hIL-10 z Pharmingen (San Diego, Kalifornia, USA). Wyniki Dwuskładnikowy promotor C3-tat / HIV jest szeroko reagującym czujnikiem przewlekłego zapalenia. Aby osiągnąć fizjologiczną regulację transgenów przeciwzapalnych, element promotorowy powinien spełniać określone kryteria. Po pierwsze, powinna odpowiadać głównym mediatorom prozapalnym. Po drugie, aby zapewnić duży dynamiczny zakres odpowiedzi, powinien on mieć podstawową aktywność niskiego poziomu i wysoką indukowalność. Wreszcie, w pełni aktywowany promotor powinien być w stanie sterować wytwarzaniem wystarczającej ilości rekombinowanego białka, aby uzyskać efekt terapeutyczny. Transkrypcja wielu genów białka ostrej fazy (APP) jest kontrolowana przez indukowalne przez zapalenie promotory, które reagują na bodźce zapalne w sposób zależny od dawki. Jednak bezwzględne poziomy ekspresji możliwe do uzyskania przez wektory z endogennymi promotorami genów APP są rozczarowująco niskie w porównaniu z poziomami zapewnianymi przez silny konstytutywny promotor cytomegalowirusa (CMV) (14). W naszych poprzednich badaniach opracowaliśmy dwuskładnikowy układ ekspresyjny indukowalny przez zapalenie. Ten chimeryczny konstrukt wykorzystuje promotor genu APP z dopełniaczem 3 (C3) do kontrolowania ekspresji białka Tat Tat; w tym samym konstrukcie, Tat transaktywuje ekspresję transgenu (rX) połączonego z promotorem HIV (11) (Figura 1). Ponieważ oba promotory C3 i HIV reagują na cytokiny, ten binarny konstrukt umożliwia aktywację wytwarzania rX przez cis i trans przez mediatory stanu zapalnego. Kiedy ten element dwuskładnikowy został włączony do niezawierającej Ad i wstrzyknięty myszom, wykazywał wysoką indukowalność w kilku tkankach w odpowiedzi na endotoksynę bakteryjną i olej terpentynowy, a po indukcji osiągnął poziomy ekspresji rX porównywalne z tymi dostarczonymi przez promotor CMV (11). ). Figura Dwuskładnikowy promotor C3-tat / HIV
[więcej w: laboratorium elbląg ul nowowiejska, cykl miesiączkowy kalkulator, ziemniaki pieczone przepis ]
[patrz też: palenie papierosów a karmienie piersią, kolposkopia szyjki macicy, wojewódzka przychodnia stomatologiczna w gdańsku ]