Endogenna regulacja terapeutycznego transgenu przywraca homeostazę w stawach artretycznych cd

W tym miejscu najpierw zbadaliśmy zdolność promotora C3-tat / HIV do odpowiedzi in vitro na ważne mediatory przewlekłego stanu zapalnego. Pierwotne fibroblasty maziówkowe pochodzące ze stawów szczurów z zapaleniem stawów infekowano reporterem Ad (Ad.C3-tat / HIV-luc). Kontrolne komórki zostały zainfekowane pustym wektorem (Ad.RR5) lub Ad, która produkuje lucyferazę pod kontrolą promotora CMV (Ad.CMV-luc). Po infekcji adenowirusowej, komórki z niedoborem surowicy stymulowano LPS (10 | ag / ml), IL-1, IL-6 lub TNF-a. (każdą cytokinę stosowano w stężeniu 20 ng / ml). Bodźce aktywowały promotor C3-tat / HIV o około cztery do pięciu rzędów wielkości, a poziomy szczytowe były porównywalne z tymi, które zapewnia promotor CMV (Figura 2, aib). Należy zauważyć, że ekspresja lucyferazy sterowana CMV była również aktywowana przez te bodźce, chociaż zakres indukcji (w przybliżeniu dwukrotnej) był znacznie mniejszy niż obserwowano w przypadku promotora C3-tat / HIV. Jako IL-1, IL-6 i TNF-a są uważane za kluczowe cytokiny w przewlekłym zapaleniu, zatem pierwiastek C3-tat / HIV wydaje się być szeroko reagującym. stanu zapalnego o bardzo dużym zakresie dynamiki. Rycina 2 Dwuskładnikowy promotor C3-tat / HIV jest szeroko reagującym czujnikiem przewlekłego zapalenia. (aib) Indukcja przez główne prozapalne cytokiny in vitro. Pierwotne fibroblasty maziówkowe zakażono in vitro przez inkubację przez noc ze wskazanymi wektorami Ad przy wielokrotności infekcji 100. Dwadzieścia cztery godziny później komórki głodzono w 0,5% pożywce FBS przez 24. 48 godzin, a następnie przez 6 godzin stymulowano przez wskazane cytokiny (20 ng / ml) lub LPS (10 .g / ml). Aktywność lucyferazy w lizatach komórkowych znormalizowano do całkowitego białka. (a) Poziomy indukowalnej zapaleniem ekspresji C3-tat / HIV p są porównywalne z poziomami możliwymi do uzyskania z promotorem CMV. Dane przedstawiono jako średnią z podwójnych pomiarów w pojedynczym eksperymencie; paski błędów pokazują SD. (b) Promotor C3-tat / HIV zapewnia duży dynamiczny zakres odpowiedzi. Wartości krotności indukcji obliczono jako średnią odczytów w niezależnych doświadczeniach wykonanych w dwóch powtórzeniach (dwa eksperymenty z IL-1 i IL-6 oraz trzy eksperymenty z TNF-a i LPS). (c) Indukcja in vivo po ponownej aktywacji SCZ. W dniu 42, zwierzęta stymulowano zastrzykiem IA PG-APS w obu stawach skokowych. Tym samym stawom wstrzyknięto wskazane wektory Ad (107 PFU w 10 ul) w dniu. 2. W dniu 0 zapalenie stawów reaktywowano przez dożylne wstrzyknięcie PG-APS. Aktywność lucyferazy mierzono w ekstraktach sproszkowanych stawów (każdy słupek pokazuje średnią . SD dwóch stawów). W trzech niezależnych eksperymentach aktywność lucyferazy osiągnęła szczyt w dniu 2. 4 i pozostała podwyższona do dnia 4. Niestym., Niestymulowana; IV, dożylnie; rlu, względne jednostki lucyferazy. Nawrót SCV zapalenia stawów indukuje aktywację promotora C3-tat / HIV in vivo. Aby ocenić indukowalność promotora C3-tat / HIV przez przewlekłe zapalenie stawów in vivo, najpierw zbadano ekspresję reportera lucyferazy podczas fazy reaktywacji SCW u szczurów. Wyróżniającą cechą tego modelu jest przewidywalność nawrotów, która osiąga szczyt w ciągu 2 do 4 dni i stopniowo ustępuje (12). Ad.C3-tat / HIV-luc i kontrola Wektory reklamowe wstrzykiwano do zagruntowanych stawów skokowych 2 dni przed reaktywacją SCZ. W przypadku braku reaktywacji aktywność lucyferazy w stawach, którym wstrzyknięto Ad.C3-tat / HIV-luc była niska, ale po reaktywacji osiągnęła poziomy możliwe do osiągnięcia za pomocą konstytutywnego promotora CMV (Figura 2c). W trzech niezależnych eksperymentach aktywność lucyferazy osiągnęła maksimum w 2 do 4 dni po reaktywacji; maksymalna indukcja była w zakresie od 18 do 80 razy w porównaniu z nie reaktywowanymi stawami. Indukowana zapalnie produkcja hIL-10 in vitro. Rozważając kandydaturę transgenu na protokół terapeutyczny, stwierdziliśmy, że produkt transgenu powinien hamować liczne szlaki zapalne działające na indukowalny promotor; w przeciwnym razie indukowalny promotor może pozostać aktywowany przez niezaznaczone mediatory prozapalne. We wcześniejszych badaniach ustaliliśmy, że równoczesną supresję wielu reakcji zapalnych, w tym indukcję IL-1, IL-6 i TNF-a, można osiągnąć przez blokowanie aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kB (15, 16). Cytokina przeciwzapalna IL-10 jest silnym zewnątrzkomórkowym antagonistą aktywacji NF-kB (17,18); ponadto, kilka ostatnich doniesień wykazało skuteczność terapeutyczną nieuregulowanego transferu genu IL-10 w zwierzęcych modelach reumatoidalnego zapalenia stawów (19. 23)
[przypisy: kolposkopia szyjki macicy, dieta dukana faza uderzeniowa, aldemed zielona góra dermatolog ]
[podobne: poliklinika gdańsk, chemioterapia adjuwantowa, laboratorium elbląg ul nowowiejska ]