IFN- oraz zależna od TNF eradykacja wariantów utraty antygenu w ustalonych raków myszy ad 6

Brefeldynę A (BFA), jonomycynę i PMA zakupiono od Sigma-Aldrich. Wszystkie przeciwciała i Dimer X Kb-IgG zakupiono od BD Biosciences. Pharmingen. CFSE zakupiono od Invitrogen. Generowanie wektorów SIY i gp33 oraz transfekcja / transdukcja komórek. Generowanie wektorów iSIY-LEGFP i igp33-LEGFP opisano wcześniej (8, 38, 62). MC57G transfekowano za pomocą MerCreMer w celu wytworzenia MC57-Neo (Neo). Neo transfekowano iSIY-LEGFP lub igp33-LEGFP, wybranymi przy użyciu 5 .g / ml puromycyny, i klonowano przez rozcieńczenie ograniczające w celu wytworzenia odpowiednio MC57-SIY-Lo lub MC57-gp33-Lo. Komórki MC57-SIY-Lo lub MC57-gp33-Lo traktowano 200 nM 4-hydroksytamoksyfenem przez 4 dni w celu wytworzenia odpowiednio MC57-SIY-Hi lub MC57-gp33-Hi. Analiza komórek przez FACS. Do analizy IFN-y i wytwarzanie TNF, komórki inkubowano bez peptydu, 50 ng / ml PMA plus 5 ug / ml jonomycyny, ng / ml SIY lub ug / ml gp33 w obecności 10 ug / ml BFA w cRPMI w 37 ° C. Po 5. 6 h komórki utrwalono 4% paraformaldehydem i permeabililowano 0,5% saponiną w PBS z 1% BSA i 0,1% azydkiem. Komórki zabarwiono sprzężonym z allofikocyjaniną anty-CD8 sprzężonym z PE sprzężonym z PE anty-IFN-a, skoniugowanym z FITC anty-TNF lub kontrolą izotypową. Do analizy limfocytów T anty-SIY, Dimer X Kb-IgG obciążono 40 M nadmiarem peptydu SIY lub zmutowanego peptydu p68, a limfocyty krwi obwodowej wybarwiono zgodnie z instrukcjami producenta (BD Biosciences). Próbki analizowano w aparacie FACSCalibur, a dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo. Test cytotoksyczności in vivo. Analizę swoistej efektorowej aktywności CTL antygenu nowotworowego in vivo przeprowadzono za pomocą adaptacji metody Oehen et al. (63). Pokrótce, komórki śledziony C57BL / 6 ponownie zawieszono w PBS i podzielono na 2 równe populacje, z których jedną znakowano SIY, a drugą z peptydem gp33 w stężeniu ug / ml przez 60 min w 37 ° C . Komórki następnie znakowano CFSE w końcowym stężeniu 5 (3 M dla komórek peptydowych SIY pC (wysoki poziom CFSE) i 0,5 (3 M dla komórek pulsowanych peptydem gp33 (niski CFSE). Komórki mieszano w stosunku 1: 1, a ogółem 2 × 107 komórek wstrzyknięto dożylnie zwierzętom biorcom. Opróżnianie LN, kontralateralne LN (CLN) i śledziony zebrano 24 godziny po adopcyjnym przeniesieniu, a intensywność fluorescencji CFSE analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Bramkowanie na komórkach CFSE + procentowe zabijanie obliczono w następujący sposób: 100. ([(% SIY peptyd pulsowany w immunizowanym /% gp33 w impulsie immunizowanym) / (peptyd% SIY pulsowany w nieimmunizowanym /% peptydzie gp33 pulsowanym w nieimmunizowanym)] x100). Wyzwanie guza i adoptywny transfer limfocytów T. Hodowane komórki rakowe trypsynizowano i przemyto raz zwykłym DMEM, a 2 x 106 komórek wstrzyknięto sc pod ogolonymi grzbietami myszy. Do doświadczeń z mieszaniem myszom wstrzyknięto sc 2 x 106 komórek MC57-SIY-Hi plus 2 x 103 komórek MC57. Wielkość guza określano w 3-dniowych odstępach. Objętości guza zmierzono wzdłuż 3 ortogonalnych osi (a, b i c) i obliczono jako abc / 2. W celu przeniesienia komórek T zebrano splenocyty traktowane x 107 NH4Cl od transgenicznych myszy 2C. W celu wytworzenia limfocytów z odpornością na SIY (8), wskazane myszy immunizowano przeciw peptydowi SIY. Dziewięć dni później splenocyty hodowano przez 5 dni za pomocą peptydu SIYRYYGL i 10 U / ml IL-2. Zawiesiny pojedynczych komórek T wstrzyknięto iv do splotu pozagałkowego w objętości 0,2 ml. Statystyka. Współczynniki odrzucania guza w różnych grupach myszy porównywano stosując dokładny test Fishera. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Podziękowania Badania zostały poparte przez granty NIH: RO1-CA22677, RO1-CA37156 i PO1-CA97296 na H. Schreiber oraz przez University of Chicago Cancer Research Center w formie dotacji CA-14599. B. Zhang jest członkiem Instytutu Badań nad Rakiem. Dziękujemy Andrei Schietinger, Yi Zhang i Karin Schreiber za pomoc techniczną. Przypisy Niestandardowe skróty: ALV, wariant utraty antygenu; IFN-yR, IFN-y chwytnik; TNFR, receptor TNF. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.118: 1398. 1404 (2008). doi: 10.1172 / JCI33522 Obecny adres Bin Zhanga to: Wydział Hematologii i Onkologii Medycznej, Wydział Medycyny oraz Centrum Terapii i Badań nad Rakiem, University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA.
[hasła pokrewne: ziemniaki pieczone przepis, kolposkopia szyjki macicy, frytki z piekarnika kalorie ]
[więcej w: cykl miesiączkowy kalkulator, wojewódzka przychodnia stomatologiczna, przychodnia langiewicza rzeszów ]