Renalase to nowa, rozpuszczalna oksydaza monoaminowa, która reguluje czynność serca i ciśnienie krwi ad 5

Ponadto, zmniejszenie stężenia nerki we krwi obserwowane u pacjentów z ciężką chorobą nerek sugeruje związek przyczynowy ze zwiększoną katecholaminą w osoczu i zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym, które są dobrze udokumentowane w tej populacji pacjentów. Identyfikacja renalazy jest ważnym krokiem w kierunku bardziej szczegółowego zrozumienia fizjologii układu sercowo-naczyniowego, a być może również w dążeniu do zapewnienia optymalnego leczenia pacjentów z chorobą nerek. Metody Identyfikacja i analiza genu kodującego renalazę. Od sierpnia 2003 r. Na stronie internetowej MGC udostępniono 12 563 oddzielnych cDNA o pełnej długości dla otwartych ramek odczytu dla ludzi. Te klony poddano 3 rundom sekwencyjnego przesiewania. Najpierw do dalszej analizy wybrano geny bez definicji GenBank. Analizę homologii przeprowadzono przy użyciu podstawowego narzędzia do lokalnego ustalania położenia (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), a geny mające przewidywane sekwencje aminokwasów o tożsamości mniejszej niż 20% dla znanych białek wybrano do następnego badania. runda analizy. Zidentyfikowaliśmy około 2500 klonów po pierwszej rundzie selekcji. Po drugie, te 2500 klonów zbadano pod kątem obecności przypuszczalnych sekwencji sygnałowych przy użyciu SignalP-2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/) i SOSUIsignal Beta Version (http: //ososui.proteome.bio.tuat .ac.jp / cgi-bin / sosui.cgi. /sosuisignal/sosuisignal_submit.html). Zidentyfikowaliśmy około 140 klonów z domniemanymi peptydami sygnałowymi. Po trzecie, te 140 klonów poddano dalszej ocenie pod kątem obecności domen transbłonowych z użyciem SOSUIsignal Beta Version. Te zawierające domeny transbłonowe zostały wykluczone do dalszych badań. W ten sposób pozostało 114 klonów, które następnie poddano przeszukiwaniu domen przy użyciu bazy danych o rodzinach białek (Pfam) Protein Families (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/). Klony cDNA będące przedmiotem zainteresowania zakupiono z American Type Culture Collection (ATCC), zsekwencjonowano na obu niciach (Yale University, Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory) i analizowano przy użyciu BLAST. Analiza Northern blot. Badania przeprowadzono z całym regionem kodującym klonów będących przedmiotem zainteresowania, jak opisano wcześniej (22). Budowa kaset ekspresyjnych genów. Użyliśmy TAP do opracowania promotora 5 (3-cytomegalowirusa i 3 miejsca poliadenylacji 3 małpiego wirusa 40 w każdym z kandydujących klonów (11). Następujące startery PCR użyto do wytworzenia fragmentów TAP z renalazą: 5a-ligo, 5a-CTGCAGGCACCGTCGTCGACTTAACAatgcgaccccagggcccccccg (wielka sprawa oznacza uniwersalną sekwencję 5a-TAP, która jest stosowana jako kotwica do PCR w drugim etapie; małe litery oznaczają renalazę; specyficzna sekwencja rozpoczynająca się w miejscu inicjacji ATG); 3a-ligo, 5aCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATCAACCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTtttttagtcttcaataag (pierwsze 25 zasad obejmuje 3-sekwencyjną sekwencję a-TAP, która jest stosowana jako kotwica do PCR w drugim etapie, podkreślona sekwencja koduje HA z następującym po nim kodonem stop, TGA; sekwencja specyficzna wobec nerazynu rozpoczynająca się na końcu 3 minus kodon stop). 5. i 3. startery zastosowane do PCR w drugim etapie zostały dostarczone przez producenta (Gene Therapy Systems Inc.). Dostarczanie genów i ekspresja. Transfekcję in vitro przeprowadzono przy użyciu GenePORTER (Gene Therapy Systems Inc.) zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta. Konsekwentnie uzyskiwano wydajność transfekcji 40-60% ocenianą przy użyciu fragmentu GAP TAP jako kontroli. Hybrydyzacja in situ. Badania przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (23). W skrócie, fragment renalazowy HindIII i PstI o długości 426 pz wklonowano do wektora pBluescript II KS (+). Wektor zastosowano do syntezy sond RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) za pomocą zestawu do znakowania DIG (Roche Biochemicals). Antysens użyto do wykrycia ekspresji genu renalazy, podczas gdy nić sensowna została użyta jako kontrola. Generacja rekombinowanego białka syntazy glutationowej. Region kodujący renalazę (nt 22 <1047) zamplifikowano za pomocą PCR (primer sensowny, 5a-TTTTGGATCCATGGCGCAGGTGCTGATCGTG i antysensowny, 3a-TTTTGAATTCCTAAATATAATTCTTTAAAGC). Produkt PCR strawiono BamHI i EcoRI i wklonowano do wektora pGEX-4T (Promega) w ramce ze znacznikiem syntazy glutationowej (GST) (26 kDa) na N-końcu. Klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA i zastosowano do transformacji BL21 E. coli. Transformowane bakterie hodowano w 37 ° C przez 16 godzin w obecności 0,1. M FAD. Izopropyl-BD-tiogalaktopiranozyd (0,5 mM) dodano w ciągu ostatnich 3,5 godzin hodowli. Białko fuzyjne renalazowe oczyszczono przy użyciu Glutathione Sepharose (Amersham Biosciences). Gdy pominięto FAD podczas syntezy białka, uzyskana syntetyczna renalaza była pozbawiona aktywności oksydazy (dane nie pokazane). Przygotowanie przeciwciała [więcej w: przychodnia langiewicza rzeszów, frytki z piekarnika kalorie, dieta dukana faza uderzeniowa ] [hasła pokrewne: dieta dukana faza uderzeniowa, implanty dąbrowa górnicza, palenie papierosów a karmienie piersią ]