Renalase to nowa, rozpuszczalna oksydaza monoaminowa, która reguluje czynność serca i ciśnienie krwi ad 6

Surowice poliklonalne anty-renalase zostały wygenerowane przez Proteintech Group Inc., z rekombinowanym białkiem fuzyjnym GST-renalase stosowanym jako antygen. Surowice oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa, stosując kolumnę zawierającą całą długość nerki. Analiza Western blot. Badania przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując przeciwciała anty-HA lub przeciw-nerkowe (23). Immunolokalizacja. Ekspresję białka w ludzkiej nerce i sercu badano za pomocą surowicy poliklonalnej przeciw nerek, jak opisano wcześniej (23). Test oksydazy aminowej. Oceniliśmy zdolność renalaz do utleniania amin biogennych za pomocą zestawu do oznaczania ampleksowej monoaminooksydazy (Invitrogen Corp.). Test oparty jest na wykrywaniu H2O2 w reakcji sprzężonej z HRP przy użyciu 10-acetylo-3,7-dihydroksy-fenoksazyny (odczynnik Amplex Red, Invitrogen Corp.). Odczynnik Amplex Red reaguje z H2O2 w stechiometrii 1: 1, a powstały sygnał fluorescencji jest wprost proporcjonalny do wytwarzania H2O2, a zatem aktywności enzymatycznej oksydazy aminowej. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, przy końcowym stężeniu substratu 2 mM. Podmioty ludzkie. Próbki osocza otrzymano od 4 zdrowych osób i 8 pacjentów z ESRD. Wśród pacjentów z ESRD niewydolność nerek była spowodowana przewlekłą nefropatią cukrzycową (n = 3), nadciśnieniową postacią stwardnienia rozsianego (n = 3), śródmiąższowym zapaleniem nerek (n = 1) i autosomalną dominującą policystyczną chorobą nerek (n = 1). Pacjenci otrzymywali leczenie hemodializą 3 razy w tygodniu przez co najmniej rok. Próbki krwi pobierano przed rutynowym leczeniem dializacyjnym. Żaden z pacjentów nie otrzymał. lub. blokery, klonidyna, metylodopa lub inhibitory MAO-A lub MAO-B, i żaden nie miał w przeszłości zaburzeń psychicznych. Protokół został zatwierdzony przez Human Investigative Committee of Veteran Administration Connecticut Health Care System, a wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną, świadomą zgodę. Oczyszczanie ludzkiej nerki. Dodano siarczan amonu do końcowego stężenia 40% do 2 l próbek moczu pobranych od zdrowych ochotników. Po całonocnej inkubacji w 4 ° C, osad zebrano przez odwirowanie (10000 g przez 30 minut), ponownie zawieszono w zimnym buforze PBS zawierającym inhibitory proteazy i dializowano przez noc w 4 ° C. Renalazę oczyszczono przy użyciu kolumny powinowactwa agarozo. Adrenerazy. Oczyszczone białko wymywano za pomocą wymywania Immunopure IgG (Pierce), analizowano za pomocą SDS-PAGE i stosowano w testach oksydazy aminowej in vitro. Pomiary hemodynamiki. Szczury Sprague-Dawley (po 150. 250 g każda) znieczulono inaktyną (100 mg / kg). Cewnik polietylenowy (PE-240) umieszczono w tchawicy w celu ochrony dróg oddechowych iw lewej żyle szyjnej (PE-50) do wlewu dożylnego roztworu płynu podtrzymującego zawierającego normalną sól fizjologiczną z 6,25% BSA z szybkością 1,5 ml / 100 g masy ciała na godzinę. Temperaturę rdzenia monitorowano za pomocą termometru doodbytniczego i zastosowano poduszkę grzejną do utrzymania temperatury ciała w 37 ° C. Ciśnienie tętnicze i tętno monitorowano w sposób ciągły za pomocą cewnika PE-50 umieszczonego w lewej tętnicy szyjnej i połączono z przetwornikiem ciśnienia (AD Instruments). Nagrania hemodynamiczne poddano digitalizacji, przechowywano i analizowano za pomocą systemu akwizycji danych PowerLab / 8SP (ADIntruments). Szczurom pozwolono odzyskać godzinę po zakończeniu zabiegu chirurgicznego, a kolejne 30 minut służyło jako okres kontrolny. Grupa eksperymentalna następnie otrzymała iniekcję bolusową 0,5 mg rekombinowanej nerki w 0,5 ml PBS. Grupie kontrolnej wstrzyknięto 0,5 mg BSA lub 0,5 mg rekombinowanej transferazy glutationowej w 0,5 ml PBS. Ciśnienie krwi i tętno mierzono w sposób ciągły i rejestrowano. Aby zbadać działanie nerkowe na czynność serca, wprowadziliśmy cewnik kombinowany ciśnienie / objętość (PV) (cewnik Millar Mikro-Tip PV, model SPR-838, Millar Instruments) do prawej tętnicy szyjnej wspólnej i wprowadzono go do lewej komory w celu do pomiaru ciśnienia wewnątrzkomorowego i objętości podczas cyklu serca. Pętle PV były monitorowane w sposób ciągły przed i podczas wlewu nerki i rejestrowane za pomocą systemu akwizycji danych PowerLab (model 8SP, ADInstruments). Mierzono ciśnienie w komorze i objętość komory, obliczano częstość akcji serca, średnie ciśnienie tętnicze, pojemność minutową serca, dP / dt (kurczliwość serca), elastyczność tętnicy i układowy opór naczyniowy. Analiza statystyczna. Do porównań między dwiema grupami zastosowano standardowe, sparowane testy ucznia. Standardowe niesparowane testy ucznia zostały użyte do porównań grup w równoważnych okresach. Wszystkie dane są wartościami średnimi. SE i P <0,05 przyjęto jako statystycznie istotną różnicę. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Jesteśmy wdzięczni Michaelowi G Ziegler i Gerald F. DiBona za ich wnikliwe komentarze. Praca ta została wsparta przez Veteran Health Administration Merit Review Award (do G. Desir) i NIH udziela DK48105B (do G. Desir), DK02917 (do J. Xu) i DK064317 (do J. Xu). Przypisy Jianchao Xu i Guoyong Li w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Zastosowano niestandardowe skróty: ESRD, schyłkowa niewydolność nerek; FAD, dinukleotyd flawonadeninowy; GST, syntaza glutationowa; MAO-A, oksydaza monoaminowa A; MGC, Mammalian Gene Collection Project; TAP, transkrypcyjnie aktywna PCR. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [przypisy: chemioterapia adjuwantowa, aldemed zielona góra dermatolog, cykl miesiączkowy kalkulator ] [podobne: kolposkopia szyjki macicy, wojewódzka przychodnia stomatologiczna w gdańsku, poliklinika gdańsk ]