Renalase to nowa, rozpuszczalna oksydaza monoaminowa, która reguluje czynność serca i ciśnienie krwi ad

Te gatunki mRNA mogą reprezentować alternatywne warianty splicingowe. MGC12474 ma 474 nt, a jego najdłuższa otwarta ramka odczytu (nt 22. 1047) koduje nowe białko z 342 AA z obliczoną masą cząsteczkową 37,8 kDa (Suplementowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI200524066DS1 ). Sekwencję cDNA MGC12474 wykorzystano do przeszukania bazy danych Human Genome Project (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/), a uzyskane dopasowanie zostało użyte do ustalenia struktury egzon-intron ludzkiego genu, który nazwaliśmy renalazą. Renalaza ma 9 egzonów obejmujących około 311 000 bp i znajduje się na chromosomie 10 przy q23.33. Zbadaliśmy ekspresję białka nerkowego u szczurów metodą blottingu Western, stosując przeciwciało przeciw nerek. Jak pokazano na Figurze 1B, białko renalazę wykryto w tych samych tkankach, które zostały określone jako pozytywne dla mRNA renalazy przez Northern blotting. Przeprowadzono hybrydyzację in situ i badania immunocytochemiczne w celu określenia przestrzennego rozkładu ekspresji genów nerkowych w ludzkich tkankach. Specyficzny sygnał wykryto w kłębuszkach nerkowych, kanalikach proksymalnych (Figura 1, C = E) i kardiomiocytach (Figura 1, F i G). Figura Ekspresja tkanki w tkankach nerkowych. (A) Analiza metodą northern blot tkanek ludzkich z użyciem klonu MGC12474 jako sondy. Górny prążek w mięśniu szkieletowym i niższe pasma w nerce i wątrobie mogą reprezentować alternatywnie splicingowe formy renu. (B) Analiza Western blot tkanek szczura przy użyciu przeciwciała poliklonalnego renalazy. (C = F) Ekspresja renalazy w nerkach. (C) Analiza hybrydyzacji in situ ludzkiej nerki. Po lewej: sonda antysensowna. Otwarta strzałka wskazuje kłębuszek; wypełniona strzałka wskazuje kanaliki proksymalne. Pasek skali: 40 m. Po prawej: kontrola sondy zmysłowej. Powiększenie, × 200. (D) Immunolokalizacja w ludzkiej nerce. Po lewej: przeciwciało przeciw nerek. Wypełniona strzałka wskazuje kanaliki proksymalne. Pasek skali: 40 m. Po prawej: surowica preimmunizacyjna. Powiększenie, × 630. (E) Immunofluorescencja w ludzkiej nerce. Lewe panele: przeciwciało przeciw nerek, gruba strzałka oznacza kłębuszek; cienkie strzałki wskazują kanaliki proksymalne. Prawe panele: surowica preimmunizacyjna. Pręty skali: 40 m. (F i G) Renalase wyrażanie w sercu. (F) Analiza hybrydyzacji in situ ludzkiego serca. Po lewej: sonda antysensowna. Otwarta strzałka wskazuje naczynia krwionośne; wypełniona strzałka wskazuje miocyty komorowe. Pasek skali: 40 m. Po prawej: kontrola sondy zmysłowej. Powiększenie, × 200. (G) Immunolokalizacja w ludzkim sercu. Po lewej: przeciwciało przeciw nerek. Otwarta strzałka wskazuje naczynia krwionośne; wypełnione strzałki wskazują miocyty komorowe. Pasek skali: 40 m. Po prawej: surowica preimmunizacyjna. Powiększenie, × 630. Analiza, za pomocą MotifScan (http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/MOTIFSCAN/Motif-Scanner.html), ujawniła peptyd sygnałowy na N-końcu, miejsce wiążące FAD (AAs 4. 35 ) i domena oksydazy aminowej w AAs 75-333 (dodatkowa Figura 1). Renalaza ma 13,2% tożsamości AA z monoaminową oksydazą A (MAO-A) (dodatkowa postać 2). Renalaza jest wydzielanym białkiem. Aby sprawdzić, czy renalaza jest wydzielanym białkiem, zastosowaliśmy podejście oparte na PCR, aby wygenerować transkrypcyjnie aktywne fragmenty PCR (TAP) (11). W celu ułatwienia wykrywania produktu białkowego opracowaliśmy również znacznik HA na C-końcu renalazy. Komórki HEK293, które zostały transfekowane fragmentem TAP z renalazą, były zdolne do wydzielania renalazy w pożywce hodowlanej. Jak pokazano na Figurze 2A, analiza Western z użyciem zarówno przeciwciał anty-HA jak i przeciw-nerkowych ujawniła białko w przybliżeniu 35 kDa w pożywce hodowlanej, co wskazuje, że renalaza ma funkcjonalną N-końcową sekwencję sygnałową i jest wydzielana w modelu hodowli komórkowej. stosowane w tych badaniach. Uznaliśmy, że jeśli renalaza jest wydzielana in vivo, powinna być wykrywalna w moczu lub krwi. Ludzkie osocze badano techniką Western blot stosując specyficzne wobec renalazy przeciwciało poliklonalne. Jak pokazano na ryc. 2B, nerka była łatwo wykrywalna w osoczu osób zdrowych. Aby ustalić, czy nerka jest ważnym źródłem wydzielanej nerki, zbadaliśmy poziomy nerkowej nerki u pacjentów cierpiących na ciężką chorobę nerek i zmniejszoną czynność nerek. Jak pokazano na ryc. 2B, nerka była praktycznie niewykrywalna we krwi pacjentów z ESRD poddawanych hemodializie. Figura 2Renalaza jest wydzielaną oksydazą aminową. (A) Wykrywanie renalazy w pożywce hodowlanej komórek HEK293 przejściowo transfekowanych cDNA z renalazą. Kontrola, samo przeciwciało drugorzędowe. (B) Analiza Western blot ludzkiego osocza z użyciem przeciwciała przeciw-nerazowego. Normalne, osocze od osób z prawidłową czynnością nerek; Białko kontrolne, ludzkie rekombinowane białko nerkowe; ESRD, osocze od pacjentów z ESRD otrzymujących hemodializę
[przypisy: cukrzycowa choroba nerek, przepis na dietetyczne ciasto, zdrowe jedzenie przepisy ]
[więcej w: kuchnia niemiecka prezentacja, wojewódzka przychodnia stomatologiczna gdańsk, ortodonta gdańsk nfz ]