Szybkie wytwarzanie szerokiej odporności komórek T u ludzi po pojedynczym wstrzyknięciu dojrzałych komórek dendrytycznych ad

Osoby z zaburzeniami psychicznymi, nadużywaniem substancji czynnych, alergią na gentamycynę (stosowaną w pożywce), ciążą lub chorobą autoimmunologiczną (w tym pozytywny czynnik reumatoidalny lub przeciwjądrzaste przeciwciało w surowicy [ANA]) zostały wyłączone. Badanie zostało zatwierdzone przez Food and Drug Administration. Wszyscy uczestnicy podpisali świadomą zgodę zgodnie z wytycznymi Rady ds. Instytucji Rewizyjnej Uniwersytetu Rockefellera. Podstawowe badania. Wszyscy uczestnicy badania zostali przetestowani na obecność HLA-A * 0201 i byli początkowo obserwowani przez okres od 2 do 12 miesięcy, podczas których wykonywano 2. 4 podstawowe pomiary odpowiedzi immunologicznej. Testy laboratoryjne na początku obejmowały pełną morfologię krwi, profil chemiczny, serię zapalenia wątroby typu B i C, serologię HIV, czynnik reumatoidalny, ANA, szybkość sedymentacji, analizę moczu, prześwietlenie klatki piersiowej, test ciążowy i serologię grypy. Anergiczny panel składający się z drożdżaków, świnki i tężca został umieszczony na linii podstawowej u wszystkich z wyjątkiem dwóch osobników (D4 i D7). Pomiar odpowiedzi immunologicznej Proliferacja specyficzna dla antygenu. PBMC w 2 poziomach dawek (3 x 104 i x 105 komórek na studzienkę) hodowano w trzech dołkach w nieobecności lub w obecności stopniowanych dawek antygenów. Antygen i dawki były następujące: toksoid tężca (TT) przy stężeniu 3. 3 000 ng / ml, KLH przy 1. 10. G / ml i jako kontrola pozytywna, 0,001. 1,0 ng / ml enterotoksyna gronkowcowa A (SEA). Testy pulsowano [3H] tymidyną po 3 dniach (SEA) lub 5 (TT i KLH) hodowli i zebrano 8 godzin później. W przypadku niektórych eksperymentów PBMC były pozbawione komórek T CD4 + lub CD8 + przez panoramowanie przed użyciem w testach proliferacji i immunoelektomii immunologicznej (ELISPOT). Test ELISPOT dla IFN-y uwalnianie z pojedynczych komórek T specyficznych względem antygenu. Jak opisano w innym miejscu (16, 17), stopniowane dawki PBMC (25 x 103 do 2 x 105 komórek na studzienkę) dodano do płytek wstępnie powleczonych 10 ug / ml pierwotnego anty-IFN-y. mAb (Mabtech, Sztokholm, Szwecja) w obecności lub nieobecności antygenów, w celu stymulacji IFN-y wydzielanie. Płytki inkubowano przez noc (12. 18 godzin) w 37 ° C, a następnie studzienki inkubowano ze skoniugowanym z biotyną anty-IFN-y. przeciwciało (1 .g / ml; Mabtech). Po zabarwieniu zestawem Vectastain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA), zabarwione plamy wskazywały komórki wydzielające IFN-y. Antygeny były następujące: 10. M HLA-A * 0201 ograniczony peptyd dla grypy (MP) (GILGFVFTL) (18) i 1. G / ml HLA-A * 0201 ograniczony peptyd gag HIV (SLYNTVATL) (jako kontrola). W celu wykrycia odpowiedzi swoistych dla grypy PBMC infekowano żywym wirusem grypy (moi = 2). Odpowiedzi zliczono jako pozytywne, jeśli wykryto co najmniej 10 komórek tworzących plamki (SFC) na 2 x 105 komórek po odjęciu kontroli i jeśli liczba plam była co najmniej dwukrotnie większa niż w studzienkach kontroli negatywnej. Wszystkie testy przeprowadzono na świeżych PBMC. Tam, gdzie to możliwe, u niektórych osobników równe porcje PBMC sprzed immunizacji przed i po immunizacji również rozmrożono i zbadano łącznie. Testy CTL. Specyficzne dla MP komórki zabijające oznaczano ilościowo po stymulacji komórkami T (2 x 105 komórek T na studzienkę) impulsowymi antygenami DC (MP wirusa grypy [1 .M], żywym lub dezaktywowanym żywym wirusem grypy [moi = 2]). Stosunek DC / T o 1:30 przez 7 dni (19, 20). Aktywność CTL mierzono w standardowym 5-godzinnym oznaczeniu uwalniania 51Cr w stosunku efektor / cel (E / T) 20: 1. Dla pacjentów HLA-A * 0201a-pozytywnych, celami były komórki T2 poddane pulsowi z .M MP lub nie spodziewane komórki T2 jako kontrole. U pacjentów HLA-A * 0201 ujemnych autologiczne limfoblastoidalne linie komórkowe B zainfekowane żywą grypą (moi = 10) lub wektorami krowianki (moi = 5) niosącymi białko macierzy grypy lub gen kinazy tymidynowej (jako kontrolę, dar B. Mossa , National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) służyły jako cele. Wiązanie z kompleksami tetrameru HLA klasy I. Rozpuszczalne tetramery MP-HLA-A * 0201 wirusa grypy przygotowano, a wiązanie do tetramerów analizowano za pomocą FACS. analiza (21). Zamrożone porcje PBMC przed immunizacją i po immunizacji zostały rozmrożone razem w ślepy sposób. PBMC hodowano in vitro ze świeżo wytworzonymi autologicznymi DC pulsowanymi MP (w przeciwieństwie do braku peptydu jako kontrolą) przy stosunku DC / T wynoszącym 1:30 przez 7 dni przed barwieniem i analizą. Generacja DC. DC wytworzono z prekursorów monocytów krwi, jak opisano (22). W skrócie, komórki jednojądrzaste wysiano na 6-studzienkowe płytki do hodowli przy 8 x 106 komórek na dołek i pozostawiono do przylgnięcia do plastiku na 2 godziny. Plastyczne komórki adherentne hodowano w RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, Maryland, USA) uzupełnionym 1% autologicznego osocza, 20 ug / ml gentamycyny (klasa kliniczna, Fujisawa USA, Deerfield, Illinois, USA), 800 U / ml GMP stopień IL-4 (Cell Genix, Freiburg, Niemcy) i 100 IU / mL GM-CSF o stopniu czystości 100 IU (Immunex, Seattle, Washington, USA) przez 7 dni
[patrz też: ziemniaki pieczone przepis, kuchnia niemiecka prezentacja, chemioterapia adjuwantowa ]
[więcej w: dieta dukana faza uderzeniowa, implanty dąbrowa górnicza, palenie papierosów a karmienie piersią ]