Szybkie wytwarzanie szerokiej odporności komórek T u ludzi po pojedynczym wstrzyknięciu dojrzałych komórek dendrytycznych cd

Hodowle uzupełniono cytokinami w dniach 2, 4 i 6. W dniu 7 komórki przeniesiono na nowe płytki i hodowano w obecności 50% (obj./obj.) Pożywki kondycjonowanej przez monocyty (MCM) przez 2 dodatkowe dni. Stosując tę metodologię, 1,5 x 106 do 4 x 106 dojrzałych DC eksprymujących wysokie poziomy CD86, CD83 i HLA-DR i pozbawionych innych markerów linii (np. CD14), wytwarzano w sposób odtwarzalny z 80 ml krwi obwodowej. MCM wytworzono przez przywieranie 50 x 106 PBMC w 7 ml 1% autologicznego osocza do płytek wstępnie powleczonych 100 .g / ml ludzkiej IgG (Bayer Corp., Elkhart, Indiana, USA) przez 90 minut. PBMC zebrano po całonocnej hodowli adherentnych komórek i przesączono i zamrożono w temperaturze ~ 20 ° C przed użyciem. Wykazaliśmy wcześniej, że dojrzałe DC generowane przy użyciu tej metodologii są silnymi stymulatorami w mieszanej reakcji limfocytów przy stosunkach T / DC 900: (22). DC injection. Pierwszym wstrzyknięciem było wstrzyknięcie kontrolne, w którym nie dodano żadnego antygenu. Nastąpiło to po 4. 6 tygodniach po wstrzyknięciu antygenowo-impulsowych DC. Antygeny dodawano do DC przez noc na dzień przed wstrzyknięciem. Antygeny były następujące: 10 .g / ml KLH (odwirowany, wolny od LPS, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Kalifornia, USA), 10 .g / ml TT (Statens Serum Institute, Kopenhaga, Dania) i . M HLA-A * 0201 ogranicza grypę MP (wytwarzaną w ramach dobrej praktyki laboratoryjnej przez A. Houghton, Sloan-Kettering, Nowy Jork, Nowy Jork, USA). W dniu wstrzyknięcia (tj. Dnia 9 lub 10 hodowli) DC były przemywane bez antygenu i ponownie zawieszane w normalnej soli fizjologicznej zawierającej 5% autologicznego osocza w dwóch porcjach 0,2 ml. Fenotyp i czystość wstrzykniętych DC monitorowano przez ekspresję związanego z DC zależnego markera CD83 (23), za pomocą cytometrii przepływowej. DC wstrzyknięto w postaci powierzchownej iniekcji podskórnej w 2 sąsiadujących miejscach na górnym ramieniu wewnętrznym, 4 cale od osi pachowej. Wszystkie wstrzyknięte preparaty DC były ujemne pod względem zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego. Wszystkich pacjentów obserwowano przez noc w Szpitalu Uniwersyteckim Rockefeller. Tylko kontrola antygenu. U 4 osób kontrolnych badane antygeny (TT, KLH i MP) wstrzykiwano bez DC lub innego adiuwantu w stężeniu 10 .g / ml w 0,4 ml normalnej soli fizjologicznej, jako oddzielne iniekcje podskórne. Pacjenci byli oceniani po 48 godzinach (w przypadku reakcji miejscowej) oraz po 7 i 30 dniach po wstrzyknięciu w celu wykazania odpowiedzi odpornościowej. Kontynuacja i monitorowanie. Wszyscy pacjenci byli oceniani 24 i 48 godzin po każdym zastrzyku DC pod kątem występowania reakcji DTH lub innej wczesnej toksyczności i byli obserwowani w klinice 7 i 30 dni po każdym wstrzyknięciu dla pomiaru odpowiedzi immunologicznych. Kolejna obserwacja trwała co 1-3 miesiące. U osób, które miały wstępne testy skórne, testy powtórzono 30 dni po zakończeniu zastrzyków DC pulsowanych antygenem. Trzydzieści dni po wstrzyknięciu DC, a następnie co 3 miesiące wszyscy pacjenci mieli powtarzany hemogram, panel do oznaczania stężenia w surowicy i testy laboratoryjne na czynnik reumatoidalny i ANA. Żaden z pacjentów nie wykazywał serologicznych objawów ostrego zakażenia wirusem grypy podczas badania. Analiza statystyczna. Do analizy odpowiedzi immunologicznej porównano wartości przed immunizacją i po immunizacji za pomocą sparowanego testu t po logarytmicznej transformacji danych. Wytwarzanie odpowiedniej odpowiedzi odpornościowej zdefiniowano przed badaniem jako. 2-krotne zwiększenie proliferacji swoistej dla antygenu dla KLH i TT lub liczby komórek produkujących IFN W teście ELISPOT. Istotność ustalono na poziomie P <0,05. Wyniki Charakterystyka kliniczna. Charakterystykę kliniczną osobników przedstawiono w Tabeli 1. Osiem zdrowych osób (5 HLA-A * 0201a-dodatnich i 3 HLA-A * 0201-ujemnych) otrzymało wstępną kontrolę wstrzyknięcia autologicznych DC bez antygenu, po czym miesiąc później wstrzyknięty prądem stałym DC. U dodatkowego osobnika (D5) pominięto kontrolę wstrzyknięcia przed DC impulsów antygenowych. Pulsowanie DC za pomocą TT zostało pominięte u 3 osób, u których wystąpiło znaczące stwardnienie i rumień (> 30 mm) do wyjściowego testu skórnego TT (D1, D3, D8). Czterech dodatkowych osobników kontrolnych (3 HLA-A * 0201a-dodatni [A1-A3] i HLA-A * 0201-ujemny [A4]) wstrzyknięto sam antygen pod nieobecność adiuwantu lub DC. Mediana dawki komórkowej iniekcji DC kontrolnej wynosiła 2 x 106 komórek; do iniekcji DC pulsowanej antygenem, 2,8 x 106 komórek. Procent wstrzykniętych komórek CD83 + w preparatach był zmienny (zakres 19. 95%), ze względu na zmienne zanieczyszczenie komórek T; jednak> 85% dużych komórek to CD83 +. Tabela Charakterystyka pacjenta Toksyczność. Wstrzyknięcie kontrolnych DC było dobrze tolerowane, bez żadnej lokalnej reakcji lub toksyczności układowej (Tabela 1)
[przypisy: implanty dąbrowa górnicza, chirurgiczne leczenie otyłości, laboratorium elbląg ul nowowiejska ]
[podobne: kolposkopia szyjki macicy, wojewódzka przychodnia stomatologiczna w gdańsku, poliklinika gdańsk ]