Wirusowe białko, które selektywnie obniża poziom ICAM-1 i B7-2 i moduluje kostymulację komórek T ad

Białka te, kodowane przez geny K3 i K5 KSHV, nie są powiązane z innymi białkami wirusowymi lub komórkowymi, ale mają ze sobą 40% identyczności sekwencji aminokwasów. Są zlokalizowane w retikulum endoplazmatycznym (ER), ale pośredniczą w ich działaniu dystalnie w szlaku wydzielniczym, promując endocytozę powierzchniowych łańcuchów MHC-1. Ta regulacja w dół MHC-1 była również obserwowana ostatnio w hodowanych liniach komórkowych PEL poddawanych litycznej reaktywacji KSHV (37). Ponieważ KSHV w przeważającym stopniu infekuje limfocyty B (36, 38), typ komórki właściwy do prezentacji limfocytów T w antygenach, postawiliśmy hipotezę, że wirus ten może również kodować białka, które specyficznie zmieniają aktywację komórek T. W związku z tym przetestowaliśmy zdolność K3 i K5 do modulowania wyświetlania powierzchni składników zaangażowanych w tworzenie lub funkcję synapsy immunologicznej. Metody Plazmidy. Oznaczoną przez Ha wersję K3 i oznaczoną flagą wersję K5 subklonowano z pCR3.1-HaK3 i pCR3.1-HaK3 do wektora retrowirusowego PMX (dostarczone przez L. Laniera, University of California w San Francisco, San Francisco, Kalifornia, USA). PMX-pie zawiera wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) pomiędzy miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) a wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Umożliwia to translację zarówno genu będącego przedmiotem zainteresowania (klonowanego do MCS), jak i EGFP z pojedynczego bicistronowego mRNA transkrybowanego z wirusowego długiego końca powtórzenia. Ponadto, ciasto PMX eksprymuje gen oporności na puromycynę z promotora SV40. Oznaczoną flagą wersję genu K5 subklonowano z wektora pCR3.1-FlagK5 do pBMN-ZIN (uprzejmie dostarczona przez G. Nolan, Stanford University). Ten wektor retrowirusowy umożliwia ekspresję FlagK5 i genu oporności na neomycynę z pojedynczego bicistronowego mRNA. Wektory wyrażające dynaminę typu dzikiego lub ujemny wynik transfekcyjny K44E dynamin-1 były dostarczone przez R. Vallee (University of Massachusetts Medical School). Plazmidy kodujące gen lucyferazy pod kontrolą elementów transkrypcyjnych RE / AP, NFAT, AP-1 lub NF-kB zostały dostarczone przez J. Shapiro (University of California w San Francisco). Ab i odczynniki. Do analizy FACS użyto wszystkich Abs w stężeniu .g / 106 komórek. Anty-CD18, -CD33, -CD43, -CD45 i -CD48 zostały dostarczone przez L. Laniera (University of California w San Francisco). Anty-CD19, -CD20, -CD22, -CD40, -CD58, | ICAM-1, | B7-1, | B7-2, | MHC-II i -y2m zakupiono od PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). USA). MAb sprzężone z anty-Ha znakowaną fluoresceiną zakupiono z Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Enterotoksynę gronkowcową E (SEE) zakupiono od Toxin Technology Inc. (Sarasota, Floryda, USA). Zastosowano chlorek amonu (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey, USA) w stężeniu 50 mM. Octan tromradekanoiloforbolu (TPA) (Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, Kalifornia, USA) zastosowano w stężeniu 20 ng / ml i zastosowano jonomycynę (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) przy 500 nM. Fugene6 pochodził z Roche Diagnostics Corp. (Indianapolis, Indiana, USA) i stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. Linie komórkowe. BJAB, 721,221 i komórki Jurkat hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% FCS i penicyliną-streptomycyną. Linię komórkową NKL hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% FCS, penicyliną-streptomycyną, brakiem niezbędnych aminokwasów, 5,5 x 102 mM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminą, mM pirogronianem sodu, i 200 U / ml ludzkiej rekombinowanej IL-2 (Roche Diagnostics Corp.). Transfekcje i testy lucyferazy. Komórki przemyto i zawieszono ponownie przy 2 x 107 komórek / ml. Łącznie 450 .l komórek i 20 .g DNA poddano elektroporacji w kuwecie z przerwą 0,4 cm przy 250 V, 960 .F, przy użyciu pulsatora genowego BioRad (Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, California, USA). . Dla testów lucyferazy komórki lizowano bezpośrednio do dołków przy użyciu 30 .l 5 × reporterowego bufora do lizy (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Pięćdziesiąt mikrolitrów ekstraktu wykorzystano następnie do oznaczenia ilościowego za pomocą DL-Insty (Turner Designs Inc., Sunnyvale, Kalifornia, USA) lub luminometru Optocomp-1 (MGM Instruments Inc., Hamden, Connecticut, USA). Infekcja retrowirusowa. W przypadku transfekcji wektorami retrowirusowymi (PMX-pie lub pBMN), linia komórek pakujących Phoenix wytwarza cząsteczki wirusa z wadami replikacji, które można stosować do stabilnej ekspresji w komórkach BJAB. Komórki Phoenix transfekowano stosując Fugene6 zgodnie z zaleceniem producenta. Supernatant zawierający wirusa zebrano 48 godzin po transfekcji, przesączono przez filtr 0,45 .m i rozcieńczono polibrenem (końcowe rozcieńczenie 4 ug / ml)
[patrz też: palenie papierosów a karmienie piersią, cukrzycowa choroba nerek, nadciśnienie tętnicze profilaktyka ]
[przypisy: poliklinika gdańsk, chemioterapia adjuwantowa, laboratorium elbląg ul nowowiejska ]