Wirusowe białko, które selektywnie obniża poziom ICAM-1 i B7-2 i moduluje kostymulację komórek T cd

Komórki BJAB (5 x 106) infekowano wirusem (800 g przez 2 godziny w 20 ° C) przy użyciu 2 ml supernatantu wirusa. Selekcję transdukowanej BJAB rozpoczęto 36 godzin po zakażeniu przez dodanie 1,5 mg / ml G418 lub .g / ml puromycyny. Analiza cytometrii przepływowej. Komórki płukano w PBS 1% BSA i inkubowano ze specyficznymi mAb (1 ug / 106 komórek) przez 30 minut w 4 ° C. Związane mysie Ab. S zostały ujawnione przez kozie anty-mysie skoniugowane z R-fikoerytryną. Fluorescencję powierzchni komórek analizowano za pomocą Becton Dickinson FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia, USA). W celu barwienia wewnątrzkomórkowego komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie przed inkubacją ze swoistym anty Ab Ha w buforze zawierającym 0,02% saponiny (Sigma Chemical Co.). Stymulacja komórek Jurkat. Komórki Jurkat przejściowo transfekowano plazmidami kodującymi gen lucyferazy pod kontrolą multimeryzowanych kopii elementów transkrypcyjnych RE / AP, NFAT, AP-1 lub NF-kB. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji, 104 transfekowane komórki Jurkat stymulowano 104 komórkami BJAB i SEE (200 ng / ml) w końcowej objętości 100 ul. Szesnaście godzin po stymulacji komórki zebrano w celu oznaczenia lucyferazy. Do eksperymentów blokujących użyto Abs w końcowym stężeniu 10 .g / ml i dodano do komórek BJAB 30 minut przed dodaniem komórek Jurkat i SEE. Jako pozytywną kontrolę skuteczności transfekcji, transfekowane komórki Jurkat inkubowano z TPA (20 ng / ml) i jonomycyną (500 nM). Cytotoksyczność zależna od komórek NK. Cytotoksyczność linii komórkowej NKL mierzono w standardowym 4-godzinnym oznaczeniu uwalniania 51Cr, stosując jako komórki docelowe komórki znakowane Na251CrO4. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie w różnych stosunkach efektor-do-celu. Procent swoistego uwalniania 51Cr (liza specyficzna) obliczono zgodnie ze wzorem: procent lizy właściwej = [(uwalnianie eksperymentalne. Uwalnianie spontaniczne) / (maksymalne uwalnianie. Uwalnianie spontaniczne)] x 100. Wyniki K5, ale nie K3 w dół reguluje B7- 2 i ICAM-1. Aby odnieść się do możliwości, że K3 lub K5 mogą modulować inne składniki APC zaangażowane w aktywację immunologiczną, transdukowaliśmy linię komórek B (BJAB) wektorami retrowirusowymi wyrażającymi K3 lub K5. Masowe kultury każdej transdukcji, reprezentujące pule ponad 100 000 kolonii pierwotnych transduktywów, wybrano do testu. Każda pula wykazywała silną regulację w dół MHC-1 i (2-mikroglobuliny (> 2m), co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. (Rysunek 1). Komórki te następnie testowano na poziomy powierzchni B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) i ICAM-1 (CD54). Jak pokazano na rysunku 1, ekspresja K3 nie wpłynęła na rozkład powierzchni żadnej z tych cząsteczek. Jednakże ekspresja K5 zmniejszała ekspresję powierzchni B7-2 od 60 do 100 razy, podczas gdy nie miała ona wpływu na akumulację powierzchni B7-1. Komórki eksprymujące K5 wykazywały równie duży ubytek w barwieniu powierzchni ICAM-1. Te dekrementy były specyficzne: ani K5 (Figura 1) ani K3 (dane nie pokazane) zmniejszały poziomy powierzchni MHC-II, CD43, CD58, CD40, CD48, CD33, CD22, CD20, CD19 lub CD18. Zatem ta obniżka nie jest wynikiem globalnej redystrybucji wszystkich polipeptydów z błony komórkowej BJAB. Nie jest to również wynik nadekspresji K5: poziomy mRNA specyficznego dla K5 są w rzeczywistości niższe w tych liniach niż w indukowanych litycznie komórkach BCBL-1 (L. Coscoy, dane niepublikowane). Podczas gdy manuskrypt był poddawany przeglądowi, podobne wyniki opisali Ishido i in. (39). Figura 1Powierzchniowa ekspresja cząsteczek związanych z aktywacją komórek T. Komórki BJAB poddano transdukcji wektorami retrowirusowymi PMX-pa (jako kontrolą), PMX-FlagK5 lub PMX-HaK3. Komórki były wybarwione mAb skierowane przeciwko białkom błon komórkowych B związanym z aktywacją komórek T (MHC-II, B7-2, B7-1, ICAM-1, CD58, CD45 i CD43), jak również inne białka błony komórkowej B jako kontrola (CD48, CD40, CD33, CD22, CD20, CD19, CD18,> 2m). Związane Ab. S zostały ujawnione przez kozie anty-mysie skoniugowane z R-fikoerytryną. I intensywność fluorescencji monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej. WT, typu dzikiego. Aby zbadać losy łańcuchów B7 i ICAM, zapytaliśmy, czy zniknięcie tych łańcuchów z powierzchni komórki, podobnie jak w przypadku łańcuchów MHC-I i 22m, było spowodowane zwiększoną endocytozą. W tym celu zapytaliśmy, czy poziomy powierzchni obniżonych białek mogą zostać przywrócone przez koekspresję mutanta negatywnego dominującego w dynaminie. Dynamin jest niezbędnym uczestnikiem endocytozy, a jej hamowanie selektywnie blokuje szlak endocytowy. Mutacja dynamin K44E jest ujemna dla funkcji dynaminy i silnie hamuje funkcję dyniny (dzikiego typu) (40), co czyni ją przydatnym odczynnikiem do tego celu
[hasła pokrewne: frytki z piekarnika kalorie, dieta dukana faza uderzeniowa, nietolerancja laktozy badania ]
[więcej w: chirurgia stomatologiczna gdańsk, cykl miesiączkowy kalkulator, wojewódzka przychodnia stomatologiczna ]