Wirusowe białko, które selektywnie obniża poziom ICAM-1 i B7-2 i moduluje kostymulację komórek T czesc 4

Efekt ten jest swoisty, ponieważ nadekspresja K44E nie wpływa na ekspresję na powierzchni komórkowej innych cząsteczek, na przykład CD58 (Figura 2a). Dane te wskazują, że, tak jak w przypadku MHC-I, działanie obniżające działanie białka K5 wywierane jest głównie przez endocytoza jego celów ICAM i B7. Figura 2 (a) Endocytoza białek błon komórkowych B w ekspresji B5AB z K5. Komórki BJAB eksprymujące K5 transfekowano 20 .g wektora ekspresyjnego dla znakowanego Ha znakowanego mutanta transaminowego dynaminy (wiadomo, że specyficznie blokują zdarzenia endocytozy) lub wektora ekspresyjnego dla dynamin typu dzikiego znakowanego Ha (jako kontrola). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki inkubowano z mAb skierowanym przeciw MHC-I, B7-2, ICAM-1 lub CD58 i związane mAbs ujawniono przez inkubację z kozim anty-mysim skoniugowanym z R-fikoerytryną. . Następnie komórki utrwalono, inkubowano w obecności saponiny ze skoniugowanym z fluoresceiną mAb skierowanym przeciwko znacznikowi Ha i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiają ekspresję powierzchni komórkowej białek MHC-I, B7-2, ICAM-1 i CD58 w komórkach transfekowanych dynaminą. (b) Komórki BJAB eksprymujące K5 lub komórki kontrolne inkubowano przez 12 godzin w obecności 50 mM chlorku amonu. Komórki następnie utrwalono, inkubowano z mAb p wobec B7-2 i ICAM-1 w obecności saponiny i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Jaki jest los łańcuchów, które przeszły endocytozę. Figura 2b pokazuje, że obniżone poziomy barwienia powierzchni obu cząsteczek są odzwierciedlone przez obniżony poziom wewnątrzkomórkowej akumulacji łańcuchów, co ujawniono przez analizę metodą cytometrii przepływowej w obecności saponiny. Sugeruje to, że łańcuchy uległy degradacji po internalizacji. Ta degradacja może być częściowo złagodzona przez ekspozycję komórek na działanie chlorku amonu, który podnosi pH endolizosomalne i upośledza aktywność proteazy w tym przedziale (Figura 2b). Sugeruje to, że większość nowo internalizowanych łańcuchów ulega rozkładowi przez proteazy endolizosomalne. Znaczenie funkcjonalne regulacji poziomu B7-2 i IC50 za pośrednictwem K5. Następnie testowaliśmy znaczenie funkcjonalne obniżenia poziomu ICAM-1 i B7-2 w stymulacji limfocytów T towarzyszącą prezentacji antygenu. Ponieważ K5 nie działa w komórkach mysich (nr ref. 35, L. Coscoy, dane niepublikowane), nie byliśmy w stanie zastosować standardowych testów in vitro obejmujących specyficzną antygenową stymulację pierwotnych komórek T z myszy transgenicznych TCR. Dlatego użyliśmy zamiast tego systemu modelowego, który wykorzystuje hodowane ludzkie linie komórek T i B i zastępuje konwencjonalny antygen superantygenem gronkowcowym (41). Superantygeny naśladują konwencjonalne antygeny, ponieważ prowadzą do funkcjonalnych interakcji TCR z cząsteczkami MHC; jednakże mają one tę zaletę, że umożliwiają rozpoznanie wielu regionów v TCR, wytwarzając silne odpowiedzi komórek T. Nasz test mierzy zdolność komórek BJAB (mających lub pozbawionych genów K5) do stymulacji komórek T Jurkat w obecności SEE. Aktywacja jest testowana przez regulację w górę kilku czynników transkrypcyjnych, o których wiadomo, że są stymulowane przez zaangażowanie komórek T-APC, w tym NFAT i AP-1. Ponieważ ich regulacja w górę jest oporna na CTLA4-Ig, aktywacja NFAT i AP-1 odzwierciedla szlaki stymulacyjne inne niż te, w których pośredniczy B7-CD28 (42), najprawdopodobniej te, w których pośredniczy sygnalizacja ITAM oparta na TCR. (Wiadomo, że te szlaki są wzmacniane przez oddziaływania ICAM / LFA-1). Aby zbadać szlaki zależne od B7-CD28a, wykorzystaliśmy fakt, że takie szlaki aktywują miejsce wiązania złożonego czynnika transkrypcyjnego. Znane jako RE / AP (42). Geny lucyferazy pod kontrolą elementu RE / AP wiernie rekapitulują zależną od CD28 kostymulację, a ich ekspresja jest blokowana przez CTLA4-Ig (42). W rzeczywistości, podwyższenie poziomu ekspresji tego reportera koreluje ściśle ze zwiększonym uwalnianiem IL-2 podczas aktywacji komórek T (42). Odpowiednio, komórki Jurkat przejściowo transfekowano reporterami lucyferazy pod kontrolą albo elementów regulatorowych RE / AP, NFAT, albo AP-1 z promotora IL-2. Szesnaście godzin po transfekcji te komórki Jurkat stymulowano przez inkubację z SEE plus kontrolnymi komórkami BJAB lub BJAB eksprymującym K5, a aktywność lucyferazy mierzono 12 godzin później. Jak pokazano na Figurze 3a, inkubacja transfekowanych komórek Jurkat za pomocą BJAB lub samego BJAB-K5 bez SEE była niewystarczająca do aktywacji promotora zależnego od RE / AP. Zgodnie z oczekiwaniami, aktywacja tego reportera była silnie indukowana przez połączenie BJAB i SEE
[przypisy: właściwości sody oczyszczonej, kolposkopia szyjki macicy, przepis na dietetyczne ciasto ]
[patrz też: przychodnia langiewicza rzeszów, frytki z piekarnika kalorie, kuchnia niemiecka prezentacja ]