Zespół Hyper-IgM typu 4 z wewnętrznym selektywnym niedoborem limfocytów B w rekombinacji z przełączaniem klasy Ig ad

W związku z tym podajemy tutaj dane od 15 pacjentów z 14 różnych rodzin. Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów lub ich rodziców. Przebieg kliniczny i dane laboratoryjne zostały retrospektywnie przejrzane za pomocą kwestionariusza wysłanego do wszystkich lekarzy kierujących. Zebrano informacje na temat wywiadu rodzinnego, wieku zachorowania, diagnozy HIGM, dożylnego podawania Ig (IVIG), cech klinicznych przed i po diagnozie, poziomów Ig w surowicy w momencie rozpoznania, cech terapeutycznych i stanu klinicznego w ostatniej obserwacji. Aktywacja komórek B i CSR in vitro. Aktywację komórek B i CSR in vitro przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (12, 14). Użyliśmy kombinacji rozpuszczalnego CD40L (sCD40L) i rekombinowanej interleukiny-4 (rIL-4), która silnie indukuje proliferację komórek B i CSR w kierunku IgE. Komórki B krwi obwodowej od zdrowych dorosłych ochotników lub dzieci dobranych pod względem wieku (po uzyskaniu zgody rodziców) badano jako kontrole. PBMC oddzielono metodą wirowania gęstości Ficoll-Hypaque (Lymphoprep; Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegia), a następnie aktywowano przez 5 dni za pomocą sCD40L (500 ng / ml, miły prezent od Immunex, Seattle, Washington, USA) i rIL-4 (100 U / ml; R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Proliferację oceniano przez pomiar wychwytu [3H] tymidyny. CSR w kierunku IgE i IgG oceniano po 12 dniach hodowli w obecności sCD40L + rIL-4 techniką ELISA (12). Wykrywanie transkryptów RNA w aktywowanych limfocytach B. RNA ekstrahowano z komórek B, które inkubowano w obecności sCD40L + rIL-4 przez 5 dni, stosując odczynnik Trizol (Invitrogen BV, Groningen, Holandia). cDNA wytworzono stosując odwrotną transkryptazę (SuperScript II, Invitrogen BV) z primerem oligo-dT (Invitrogen BV) zgodnie z instrukcjami producenta. Transkrypty RNA genów CD19, AID i linii zarodkowej genów IgE (. GLT), kół (. CT) i transkrypty funkcjonalne (. FT) i transkrypty funkcjonalne genów IgG (. FT) wykryto za pomocą RT-PCR, jak opisano wcześniej. (11, 13). Wykonano seryjne rozcieńczenia cDNA (1: do 1: 1000) w celu miareczkowania GLT. ilości transkryptu u pacjentów i kontrolnych HIGM4. Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w regionie przełączającym. ciężki łańcuch. Metodę z udziałem ligacji (PCR, LM-PCR) wykorzystano do identyfikacji pęknięć dwuniciowych (DSB) w genomowym DNA ekstrahowanym w czopach agarozowych z aktywowanych komórek B po sortowaniu FACS, jak opisano wcześniej (14). W skrócie, komórki B, które zostały aktywowane przez inkubację w sCD40L + rIL-4 przez 5 dni wybarwiono skoniugowanymi z FITC mAb anty-CD19 (Immunotech, Marsylia, Francja). Komórki następnie sortowano w obecności jodku propidyny (PI), który barwi martwe komórki (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy), stosując sorter komórek FACStarPLUS (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes New Jersey, USA). Posortowane, zdolne do życia, aktywowane komórki B (CD19 + PI3) miały czystość ponad 94%. Komórki T aktywowane mAb anty-CD3 i rekombinowaną interleukiną-2 (rIL-2) przez 7 dni zastosowano jako kontrolę ujemną. Następnie DSB wykryto metodą LM-PCR (14). Pokrótce, dwa oligonukleotydy (Bw1: 5a-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-3 (3 i Bw2: 5A -GAATTCAGATC-3a) pozostawiono do utworzenia dupleksów, a zatem do wytworzenia dwuniciowego łącznika z tępymi końcami (15). Ligazę T4-DNA (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) użyto do ligacji DNA z linkerem. Specyficzną amplifikację uzyskano dla genomowego DNA wyizolowanego z posortowanych żywotnych komórek (odpowiadających 2 × 103, 5 × 103 i 25 × 103 komórek na ścieżkę) przy użyciu pół-zagnieżdżonego PCR, ze starterem Bw1 i dwoma starterami w regionie . łańcuch ciężki (region S.) (S. ext: 5. -ATGGAAGCCAGCCTGGCTGT-3 (3 i S. int: 5 (3 -AGCCTGGCTGTGCAGGAACC-3.) (patrz Figura 4a). Przeprowadzono dwadzieścia pięć cykli pierwszego PCR (94 ° C przez minutę, 64 ° C przez minutę i 72 ° C przez 2 minuty). Jedna dziesiąta pierwszego produktu PCR została dodana do reakcji drugiej PCR i przeprowadzono 30 cykli PCR (94 ° C przez minutę, 67 ° C przez minutę i 72 ° C przez 2 minuty) (15) . Produkty LM-PCR rozdzielano na 2% żelach agarozowych, przenoszono pod próżnią z 0,4 N NaOH na błonach GeneScreen Plus (Perkin-Elmer Life Sciences Inc., Boston, Massachusetts, USA) i hybrydyzowano z sondą oligonukleotydową specyficzną dla genu, znakowaną 32P. -ATP (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Szwecja) i rozpoznanie S. region (sonda S: 5a -TCAGAAATGGACTCAGATGG-3.) (patrz Figura 4a). Figura 4 Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) podczas CSR w HIGM4. (a) Pozycje starterów i sondy stosowane w teście DSB. Wskazano kierunki i pozycje starterów i radioaktywnej Ss specyficznej sondy stosowanej w teście DSB
[patrz też: frytki z piekarnika kalorie, właściwości sody oczyszczonej, aldemed zielona góra dermatolog ]
[więcej w: pogotowie stomatologiczne gdańsk nfz, aldemed zielona góra dermatolog, nadciśnienie tętnicze profilaktyka ]