Zespół Hyper-IgM typu 4 z wewnętrznym selektywnym niedoborem limfocytów B w rekombinacji z przełączaniem klasy Ig cd

DSB wykryto metodą LM-PCR w aktywowanych komórkach B pacjentów HIGM4. Genomowy DNA sCD40L + aktywowanych rIL-4B komórek B (2 × 103, 5 × 103 lub 25 × 103 komórek na ścieżkę) od kontrolnych (C1, C2, C3) lub pacjentów HIGM4 (n = 6, P1, P2, P4, P6A P8) zligowano z dwuniciowym łącznikiem i powielono przez pół-zagnieżdżony PCR stosując łącznik (Bw1) jako starter, a także dwa specyficzne startery w S. region (S. ext i S. int). Produkty PCR poddano elektroforezie i przeniesiono na membranę przed inkubacją ze znakowaną radioaktywnie sondą specyficzną dla S (3. Radioaktywność wykryto przy użyciu urządzenia PhosphorImager. Kontrola negatywna składała się z limfocytów T aktywowanych anty-CD3 + rIL-2 (25 × 103 komórek na ścieżkę, C3). W innym zestawie eksperymentów próbkę oczyszczonych produktów LM-PCR zligowano z wektorem pCRII i transformowano do kompetentnych chemicznie komórek TOP10 przy użyciu zestawu TA Cloning Kit (Invitrogen BV). Sekwencje DNA poszczególnych klonów określono za pomocą zestawu do sekwencjonowania DNA BigDye (Perkin-Elmer Life Sciences) z primerami do przodu i do tyłu M13 i zautomatyzowanym analizatorem genetycznym ABI PRISM 377 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Wykrywanie SHM w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego Ig. Badaliśmy częstotliwość i charakterystykę SHM w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego IgM (region VH) w oczyszczonych komórkach B CD19 + CD27 +, jak opisano wcześniej (16). PBMC wyznakowano mAb anty-CD19 i mAb anty-CD27 (Immunotech), a następnie oczyszczono przez sortowanie FACS. Czystość posortowanych komórek B CD19 + CD27 + wynosiła ponad 99%. SHM zidentyfikowano w regionie VH3-23 (GenBank nr dostępu AB019439) po amplifikacji PCR przy użyciu VH3-23 i C. primery i klonowanie, jak opisano wcześniej (16). Analiza sekwencji genu glikozylazy DNA uracylu-DNA. Genomowy DNA od pacjentów amplifikowano przez PCR stosując startery, które wiążą się z sekwencjami intronowymi i niekodującymi. Produkty PCR sekwencjonowano przy użyciu zestawu do sekwencjonowania DNA BigDye (Perkin-Elmer Life Sciences), starterów wewnętrznych i zautomatyzowanego analizatora genetycznego ABI PRISM 377 (Applied Biosystems), jak opisano wcześniej (17). Wyniki Charakterystyka fenotypowa pacjentów z HIGM4. Pacjenci pochodzili z sześciu krajów (pięciu z Włoch, czterech z Francji, dwóch z Węgier, dwóch z Anglii, jednego z Turcji i jednego z Japonii). Większość przypadków była sporadyczna, bez rodzinnej historii niedoboru odporności. Jeden z 15 pacjentów urodził się w rodzinie spokrewnionej (P1), a dwóch pacjentów (P2 i P3) było braćmi urodzonymi przez rodzinę nierodzicielską. Stosunek płci 11 mężczyzn do 4 kobiet prawdopodobnie wynikał z nastawienia w rekrutacji. Średni wiek w chwili rozpoznania niedoboru odporności wynosił 8,8 roku (zakres: 0,3-23, lat). Średni wiek w chwili badania wynosił 18,7 lat (zakres: 2. 32 lata). Wszyscy pacjenci żyli i otrzymywali leczenie IVIG. Objawy kliniczne pacjentów były bardzo podobne do objawów u pacjentów z HIGM2 (tab. 1). Przed rozpoczęciem IVIG u wszystkich pacjentów występowały nawracające infekcje górnych dróg oddechowych, a u 14 pacjentów nawracające infekcje dolnych dróg oddechowych. Zgłaszano sporadycznie inne poważne infekcje (zakażenia przewodu pokarmowego, posocznica, zapalenie węzłów chłonnych i zapalenie szpiku). Często obserwowano hiperplazję limfatyczną (siedmiu pacjentów, 47%). Biopsja krezkowego węzła chłonnego od jednego pacjenta (P4) miała rozrost pęcherzykowy, ale nie zaobserwowano gigantycznych centrów kiełkujących charakterystycznych dla HIGM2 (13) (dane nie przedstawione). U 4 pacjentów (P4, P7, P10, P13) stwierdzono objawy autoimmunologiczne, szczególnie autoimmunologiczną cytopenię (tab. 1). Poziomy Ig w surowicy były typowe dla HIGM. IgM było podwyższone u dziesięciu pacjentów i w zakresie prawidłowym u pięciu pacjentów (P5, P6, P11, P13, P14). Poziomy IgM były znacząco niższe (P = 0,02), a poziomy IgG były istotnie wyższe (p <0,01), niż u pacjentów HIGM2. Stężenie IgG w surowicy było bardzo niskie (<1,0 g / l) u pięciu pacjentów (P1, P7, P8, P12, P15), natomiast pozostałe poziomy IgG (> 2,0 g / l) stwierdzono u ośmiu pacjentów. W czterech z nich (P4, P5, P11, P14) poziomy izotypów IgG były następujące: IgGl, 1,8 ^ 2,8 g / l; IgG2, niewykrywalny do 0,6 g / l; IgG3, niewykrywalny do 1,2 g / l; i IgG4; niewykrywalny do 0,1 g / l. Poziomy IgG przed IVIG nie były dostępne u dwóch pacjentów (P6, P10). IgE nie było wykrywalne u sześciu badanych pacjentów (P5. P8, P11, P14). Poziomy IgA były również niewykrywalne (<0,10 g / l) u wszystkich poza jednym pacjentem (P8) (ryc. 1). Wszyscy pacjenci wykazywali normalną liczbę krążących limfocytów i limfocytów B. [więcej w: przepis na dietetyczne ciasto, pogotowie stomatologiczne gdańsk, aldemed zielona góra dermatolog ] [patrz też: pogotowie stomatologiczne gdańsk, dieta dukana faza uderzeniowa, implanty dąbrowa górnicza ]