Znaczenie ekspresji antygenu mniejszej zgodności tkankowej przez tkanki niehematopoetyczne w modelu choroby przeszczepu przeciwko gospodarzowi z udziałem komórek T CD4 + T ad

Myszy C.B10-H2b / LiMcdJ (BALB.B) zakupiono w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) lub hodowano w naszej kolonii hodowlanej z par hodowlanych zakupionych w The Jackson Laboratory. Myszy C57BL / 6NCR (B6) zakupiono w National Laboratory Institute Cancer Institute (Frederick, Maryland, USA). Dla wszystkich eksperymentów, dobrane pod względem płci myszy w wieku od 6 do 14 tygodni były używane jako dawcy i biorcy. Myszy przechowywano w wolnym od patogenów środowisku w autoklawowanych klatkach do mikroizolacji i zaopatrzono je w autoklawowaną wodę i żywność ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą komitetu ds. Opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt Thomasa Jeffersona (Filadelfia, Pensylwania, USA). Przeciwciała monoklonalne. Płyn brzuszny zawierający przeciwciała anty-Thy-1,2 (J1j, szczurzy IgM) (10), mAb anty-CD8 (3.168, szczurzy IgM) (11) zastosowano wraz z dopełniaczem świnki morskiej (C .; Rockland, Boyertown, Pennsylvania, USA) w przypadku zubożania podzbiorów komórek. Oczyszczone pod względem powinowactwa kozie przeciwciało przeciw mysiej IgG (Cappel-Organon Teknika Corp., West Chester, Pennsylvania, USA) zastosowano do panoramowania komórek B. Do analizy chimeryzmu dawcy i analizy fenotypowej donorowych wszczepów komórek T zastosowano specyficzne dla FITC i / lub znakowane fikoerytryną przeciwciała monoklonalne dla następujących determinant: nieistotna kontrola izotypowa, Ly9.1, CD3a, CD4, CD8a, B220, i CD11c (wszystkie z Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA). Cytometrii przepływowej. Pomiędzy 0,06 i 0,125 (ig każdego z mAb inkubowano z x 106 komórek lub mniej w PBS zawierającym 1% BSA i 0,01% NaN3 (bufor do przemywania) przez 25 minut w 4 ° C. Po wielokrotnym przemywaniu w buforze do płukania, przeprowadzono natychmiast analizę fluorescencji lub komórki utrwalono w 1% paraformaldehydzie (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, Pensylwania, USA) przez 15 minut w temperaturze 4 ° C, a następnie końcowe płukanie. Analizę fluorescencji przeprowadzono na cytometrze analitycznym Beckman Coulter XL-MCL (Beckman Coulter Inc., Miami, Floryda, USA). Przepływowe bramki cytometryczne ustalono przez wykluczenie wiązania tła izotypowego przeciwciała kontrolnego. W przypadku barwienia dwukolorowego, poszczególne populacje komórek kontrolnych barwiono dodatnio kontrolowanymi przeciwciałami znakowanymi fikoerytryną i FITC, aby upewnić się, że nie zachodzą na siebie wzajemne tło w emisji fluorescencji pomiędzy dwoma fluorochromami. Przygotowanie komórek dawcy. PBS (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA) uzupełniony 0,1% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) zastosowano do wszystkich preparatywnych manipulacji BM dawcy i limfocytów. Zubożony w komórki T BM zubożony w BM (ATBM) przygotowano przez przepłukanie komórek BM z kości udowych i piszczelowych myszy-dawców, a następnie inkubację z mAb J1j (rozcieńczenie 1:50) i C. (Rozcieńczenie 1:12) przez 45 minut w 37 ° C. Komórki dawcy wzbogacone w komórki T wytworzono ze spulchnionej zawiesiny komórek śledziony i węzłów chłonnych od myszy dawcy, jak opisano wcześniej (12). W skrócie, po lizie czerwonych krwinek za pomocą zbilansowanego roztworu soli Gey zawierającego 0,7% NH4Cl, komórki B usunięto przez płukanie zawiesiny komórkowej przez kozie płytki z tworzywa sztucznego powlekane anty-mysim IgGp przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Niepadherentne limfocyty pozbawiono komórek T CD8 + przez inkubację z 3,188 mAb (rozcieńczenie 1:50) i C. (Rozcieńczenie 1:12) przez 45 minut w 37 ° C. Komórki T dawcy były wzbogacone o ponad 97% w podzbiorze CD4 +, co określono za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki wstrzyknięto iv w samym PBS. Przygotowanie chimer BM. Chimery BM przygotowano przez przeniesienie × 107 komórek ATBM iv do myszy eksponowanych 4. 6 godzin wcześniej do 13 Gy, podzielonej dawki (6,5 Gy przy 1,36 Gy / min), z promiennika gamma 137Cs Mark-1 model 68 gamma (JL Shepherd and Associates, San Fernando, Kalifornia, USA). Myszy pozostawiono do rekonstytucji przez 14-17 tygodni, po czym uśmiercano minimum trzy myszy o reprezentatywnej masie w celu określenia procentu chimeryzmu krwiotwórczego dawcy za pomocą dwukolorowej analizy cytometrii przepływowej. Analiza in vivo dla GVHD. Przeszczepienie BM przeprowadzono jak opisano wcześniej, z pewnymi modyfikacjami (12). Po 14. 17 tygodniach po rekonstytucji, chimeryczni biorcy BM (wskazani w nawiasach) zostali ponownie napromieniowani 10. 13 Gy (dawka podzielona) i wstrzyknięto dożylnie po 4. 6 godzinach donosowe podanie B6 2 x 106 komórek ATBM, w połączeniu z komórkami T o wielkości od 1,5 x 107 do 2 x 107 CD4 +. Zwierzęta monitorowano pod względem zachorowalności i śmiertelności i ważono regularnie aż do zakończenia eksperymentu. Średni czas przeżycia (MST) obliczono jako interpolowany 50% punkt przeżycia regresji liniowej przez wszystkie punkty danych śmierci, w tym zero. Porównania statystyczne między grupami eksperymentalnymi oparto na indywidualnych dniach śmierci i zostały wykonane przez nieparametryczny test rangi podpisu Wilcoxona
[patrz też: kuchnia niemiecka prezentacja, zapalenie stawu żuchwowo skroniowego, przychodnia langiewicza rzeszów ]
[więcej w: przychodnia langiewicza rzeszów, frytki z piekarnika kalorie, kuchnia niemiecka prezentacja ]